تقييم ومعالجة النشاط العصبي باستخدام المجهر المجسم ثنائي الفوتون
Summary
قمنا بتطوير مجهر ثلاثي الأبعاد ثنائي الفوتون يمكنه تصور النشاط العصبي وتقييمه ومعالجته باستخدام دقة زمانية مكانية عالية ، بهدف توضيح التسبب في الاضطرابات العصبية والنفسية المرتبطة بالنشاط العصبي غير الطبيعي.
Abstract
مكنت التطورات الحديثة في التصوير الحيوي البصري وعلم البصريات الوراثي من تصور الظواهر البيولوجية والتلاعب بها ، بما في ذلك الأنشطة الخلوية ، في الحيوانات الحية. في مجال علم الأعصاب ، تم الآن الكشف عن النشاط العصبي التفصيلي المتعلق بوظائف الدماغ ، مثل التعلم والذاكرة ، وأصبح من الممكن التلاعب بهذا النشاط بشكل مصطنع للتعبير عن وظائف الدماغ. ومع ذلك ، فإن التقييم التقليدي للنشاط العصبي بواسطة التصوير ثنائي الفوتون Ca2+ لديه مشكلة الدقة الزمنية المنخفضة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التلاعب بالنشاط العصبي بواسطة علم البصريات الوراثي التقليدي من خلال الألياف البصرية لا يمكن إلا أن ينظم في وقت واحد نشاط الخلايا العصبية ذات الخلفية الوراثية نفسها ، مما يجعل من الصعب التحكم في نشاط الخلايا العصبية الفردية. لحل هذه المشكلة ، قمنا مؤخرا بتطوير مجهر ذو دقة زمانية مكانية عالية للتطبيقات البيولوجية من خلال الجمع بين علم البصريات الوراثي والتكنولوجيا الثلاثية الأبعاد الرقمية التي يمكنها تعديل أشعة الليزر بالأشعة تحت الحمراء فيمتو ثانية. هنا ، نصف بروتوكولات التصور والتقييم والتلاعب بالنشاط العصبي ، بما في ذلك إعداد العينات وتشغيل مجهر ثلاثي الأبعاد ثنائي الفوتون (الشكل 1). توفر هذه البروتوكولات معلومات زمانية مكانية دقيقة عن النشاط العصبي ، والتي قد تكون مفيدة لتوضيح التسبب في الاضطرابات العصبية والنفسية التي تؤدي إلى تشوهات في النشاط العصبي.
Introduction
يعد التصوير ثنائي الفوتون Ca2+ تقنية مفيدة لتقييم النشاط العصبي. يمكن استخدامه لتحديد ليس فقط النشاط العصبي المطلوب للسلوك والذاكرة في الحيوانات الطبيعية 1,2 ولكن أيضا نشاط عصبي غير طبيعي يحدث في نماذج الفئران من الاضطرابات العصبية والنفسية 3,4. تم استخدام هذه التقنية لتوضيح الأساس العصبي لوظائف الدماغ. ومع ذلك ، على الرغم من أنه يمكن أن يوفر صورا عالية الدقة وعالية الجودة ، إلا أن دقته الزمنية أقل من الطريقة الفيزيولوجية الكهربية 1,3.
ساعد علم البصريات الوراثي على ابتكار الطريقة التي يفهم بها علماء الأعصاب وظائف المخ5. نظرا للقيود التقنية ، استخدمت غالبية أبحاث علم البصريات الجينية مخططات تنشيط ذات دقة مكانية منخفضة ، مما يحد من أنواع التلاعب بالنشاط العصبي التي يمكن إجراؤها وفقا لذلك. ومع ذلك ، فإن التلاعب بالنشاط العصبي على المقاييس الزمانية المكانية الدقيقة يمكن أن يكون مفيدا لفهم أكثر اكتمالا للحساب العصبي والتسبب في الاضطرابات العصبية والنفسية. تعد تقنية التصوير المجسم الدقيقة مكانيا التي يمكنها تشكيل أشعة الليزر القريبة من الأشعة تحت الحمراء فيمتو ثانية بالتغلب على هذا التحدي وتفتح العديد من الفئات التجريبية الجديدة التي كانت مستحيلة في السابق 6,7. تمكن هذه التقنية علماء الأعصاب من الكشف عن الجوانب والأمراض الأساسية للرموز العصبية الحسية والمعرفية والسلوكية التي كانت بعيدة المنال.
يتضمن الإسقاط المجسم توليد أنماط الضوء المرغوبة للوصول إلى الخلايا الفردية والشبكات الوظيفية بشكل انتقائي. تتطلب التجارب في الجسم الحي انتقالا مثاليا للضوء لاستهداف الخلايا في الدماغ الحي. يخترق ضوء الأشعة تحت الحمراء الأنسجة الحية بشكل أعمق ويمكن استخدامه لإثارة الفوتون غير الخطي (2PE) 8،9،10. وبالتالي ، يمكن استخدام المجهر المجسم ثنائي الفوتون ، والذي يجمع بين الإسقاط المجسم و 2PE ، لتقييم ومعالجة الأنشطة العصبية لاستكشاف الشبكات الخلوية والوظيفية في الجسم الحي. أوضحت التطبيقات البيولوجية الحديثة للمجهر المجسم ثنائي الفوتون النشاط العصبي والدوائر اللازمة للتعلم في القشرة البصرية 11،12 ، والبصلة الشمية13 ، والحصين14.
أبلغت العديد من المختبرات في جميع أنحاء العالم عن نتائج وتحسينات مثيرة باستخدام أنظمة التحفيز الثلاثية الأبعاد15،16،17،18،19،20،21،22،23. في النظام الموصوف هنا ، يمكن بناء نظام التحفيز المجسم كجهاز إضافي للمجهر التقليدي. يعد معدل الضوء المكاني للطور فقط (SLM) هو الجهاز الرئيسي لتعديل واجهة موجة الطائرة إلى أي شكل ، ويتم استخدام تأثير التداخل للتحكم في شدة وموقع البؤر. يوضح الشكل 2 التحفيز المجسم وتصوير مسارات الضوء. مسار الضوء الأول مخصص لوضع تصوير مسح النقاط ويتكون من رأس مسح ضوئي وكاشفات صور. مسار الضوء الثاني مخصص للتحفيز المجسم بطول موجي 1040 نانومتر ويتكون من SLM1. مسار الضوء الثالث مخصص للإضاءة الثلاثية الأبعاد بطول موجي 920 نانومتر ويتكون من SLM2 ومستشعر صورة. يمكن لوضع التصوير المجسم تسجيل الشدة من مناطق متعددة ذات أهمية عن طريق إضاءة نقاط متعددة في العينة. بهذه الطريقة ، يمكن زيادة سرعة التسجيل إلى بضع مئات من الإطارات في الثانية. لتحقيق تصوير المسح الضوئي أو التصوير المجسم بالإضاءة ، تم تقسيم الليزر 920 نانومتر إلى مسارين بواسطة مقسم شعاع بنسبة ثابتة تبلغ 3: 7. تمت محاذاة جميع العناصر البصرية على لوح بصري بأبعاد 600 مم × 600 مم. دخل الضوء المعدل من خلال منفذ الضوء على جانب الجسم المجهري ، بينما دخل ضوء التصوير بالمسح النقطي من خلال رأس المسح في الجزء العلوي من الجسم المجهري. تم دمج هذه الأضواء فوق العدسة الشيئية مباشرة وخلقت بؤرا في مستوى العينة. بالإضافة إلى ذلك ، مكن البرنامج المصمم خصيصا سير العمل المنتظم من أن يكون بسيطا ومتسقا.
في هذه المقالة ، يتم تقديم بروتوكول كامل لاستخدام التحفيز المجسم أو الإضاءة لقياس النشاط العصبي وتقييم الاتصال الوظيفي بين الخلايا العصبية. لأغراض توضيحية ، نصف هنا جراحة دماغية تستهدف منطقة الطرف الخلفي من القشرة الحسية الجسدية الأولية (S1HL) لدماغ الفأر وطريقة لتقييم النشاط العصبي ومعالجته باستخدام المجهر المجسم ثنائي الفوتون. ينقسم الإجراء التجريبي إلى أربعة أجزاء. أولا ، تم تثبيت لوحة الرأس على جمجمة الفأر باستخدام الأسمنت السني. ثانيا ، تم حقن ناقل فيروسي يعبر عن jGCaMP8f أو GCaMP6m-P2A-ChRmine بشكل تجسيمي في S1HL. ثالثا ، تمت معايرة نظام التحفيز المجسم أو الإضاءة. رابعا ، بعد الشفاء بعد العملية الجراحية والتعبير عن هذين البروتينين ، تم إجراء تصوير في الجسم الحي Ca2+ لتقييم النشاط العصبي والاتصال الوظيفي بين الخلايا العصبية باستخدام المجهر المجسم ثنائي الفوتون.
Protocol
Representative Results
Discussion
لفهم وظائف المخ ، من الضروري إجراء تقييم دقيق للدوائر العصبية الكامنة وراء وظيفة الدماغ عن طريق استخراج ديناميكيات النشاط العصبي. علاوة على ذلك ، من الضروري تحديد كيفية تغيير هذه الدوائر العصبية لتوضيح التسبب في الاضطرابات العصبية والنفسية. في الواقع ، من المعروف أن النشاط العصبي مرتفع في نماذج الفئران لمرض الزهايمر4 ومتلازمة X الهشة26 والفئران التي تعاني من ضعف وظيفة المادة البيضاء3. علاوة على ذلك ، في نموذج الماوس من الألم الالتهابي ، ترتبط زيادة تزامن النشاط العصبي والاتصال الوظيفي بين الخلايا العصبية بالأعراض24. يسمح لنا الفحص المجهري المجسم ثنائي الفوتون بمراقبة نشاط الخلايا العصبية الفردية والروابط الوظيفية بين الخلايا العصبية في وقت واحد ، وهو أمر ضروري لفهم الدوائر العصبية. استخدمنا عدسة موضوعية 25x بفتحة عددية = 1.1 بأطوال موجية تبلغ 1040 نانومتر. دالة انتشار النقطة النظرية هي توزيع غاوسي بعرض كامل بنصف أقصى 0.5 ميكرومتر أفقيا و 1.7 ميكرومتر محوريا. ومع ذلك ، فإن الفتحة العددية الفعلية أقل من 1.1 ، وحجم البقعة المقاسة على حبة مضان هو 1.2 ميكرومتر أفقيا ، و 8.3 ميكرومتر محوريا. بالنظر إلى أن قطر الخلية العصبية يبلغ حوالي 15 ميكرومتر وأن خطأ المعايرة في حدود 3 ميكرومتر ، فإن الاستهداف جيد بشكل عام. ومع ذلك ، قد تتأثر الخلايا في الاتجاه المحوري بحجم البقعة الأطول6. هنا ، وصفنا الحقن الفيروسي ، والجراحة ، ومعايرة أنظمة التحفيز المجسم أو الإضاءة ، وبروتوكولات التصوير لتقييم ومعالجة النشاط العصبي في الفئران الحية باستخدام نظام الفحص المجهري الخاص بنا.
يستغرق الأمر من 2 إلى 4 أسابيع لإكمال جميع الإجراءات التجريبية ، من زرع لوحة الرأس وحقن الفيروسات إلى الحصول على البيانات للتصوير في الجسم الحي Ca2+ باستخدام الفحص المجهري المجسم. العملية معقدة وشاقة ، ويعتمد النجاح النهائي للتجربة على عوامل متعددة ، بما في ذلك حالة نافذة الجمجمة ، التي تتأثر بالتهاب ما بعد الجراحة ، والاختيار الصحيح لمؤشر Ca2+ و opsin ، وما إذا كان يمكن تصحيح القطع الأثرية المتحركة في الصور المكتسبة. على وجه الخصوص ، هناك خطوتان مهمتان لتحقيق نتيجة ناجحة. الأول يتعلق بتثبيت لوحة الرأس والجراحة. من الأهمية بمكان أن يتم تثبيت لوحة الرأس بإحكام على رأس الماوس باستخدام الأسمنت السني. علاوة على ذلك ، من المهم تنظيف شظايا العظام والدم المتخثر بشكل متكرر باستخدام ACSF البارد أثناء الجراحة. نظرا لأن الالتزام بهذا الإجراء يقلل الالتهاب ، فقد لاحظنا بنجاح ديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة ، وهي الخلايا المسؤولة عن الجهاز المناعي للدماغ ، دون تنشيط عملياتها وأشواكها أو البنى المجهرية للخلايا العصبية27,28. القضية الثانية هي تقييم ومعالجة النشاط العصبي. اخترنا AAV2 / 8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1 للتعبير عن مؤشر Ca2+ و opsin في خلية عصبية واحدة في وقت واحد. هذا لأنه من الصعب إصابة خلية عصبية واحدة بكفاءة بأنواع مختلفة من AAV. سبب آخر لهذا الاختيار هو أن ChRmine يمكنه تنشيط النشاط العصبي بكفاءة عند 1040 نانومتر باستخدام ليزر ثنائي الفوتون12. في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن أن ChRmine ، من خلال تحور هيكله بناء على المعلومات الهيكلية التي تم الحصول عليها عن طريق المجهر الإلكتروني البارد ، يحسن وظيفته29 ، والتي تعتبر مفيدة لتحليل وظيفة الهدف في مجال علم الأعصاب. في ضوء هذه المشكلات ، من الضروري مشاركة طرق فعالة لتقييم الخلايا العصبية ومعالجتها عند قراءة النشاط العصبي وكتابة المعلومات باستخدام الفحص المجهري المجسم.
كشفت التطورات الحديثة في التصوير وعلم البصريات الوراثي عن النشاط العصبي التفصيلي الذي تنطوي عليه وظائف الدماغ مثل التعلم والذاكرة ، ومن الممكن التلاعب بشكل مصطنع بهذا النشاط العصبي للتعبير عن وظائف الدماغ30. ومع ذلك ، فإن الطرق التقليدية للتلاعب بالنشاط العصبي شديدة التوغل بسبب إدخال الألياف الضوئية في الدماغ ولأن مجموعة من الخلايا المعبرة عن الأوبسين يتم تحفيزها في وقت واحد ، مما يجعل من المستحيل التلاعب بالنشاط العصبي بدقة زمنية ومكانية. يمكن لطريقتنا التلاعب بالنشاط العصبي عن طريق تحفيز خلايا عصبية محددة فقط في الدماغ ، وبالتالي تمكين التلاعب بالنشاط العصبي بأنماط تحفيز محددة ودقة زمانية مكانية عالية. علاوة على ذلك ، من المهم ملاحظة أنه لا يمكن تقييم الاتصال الوظيفي بين الخلايا العصبية إلا في عدد صغير من الخلايا العصبية باستخدام تجارب شريحة الدماغ31 ؛ ومع ذلك ، تسمح هذه التقنية بالتقييم المتزامن للخلايا العصبية المتعددة في الحيوانات الحية.
أحد القيود الرئيسية للمجاهر الثلاثية الأبعاد الحالية هو الحاجة إلى إصلاح رأس الماوس ، مما يحد من سلوك الماوس. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير مجهر مصغر ثنائي الفوتون32 ، ومع مزيد من التصغير للجهاز ، قد يكون التصوير في الجسم الحي Ca2+ مع التحفيز المجسم ممكنا في الفئران التي تتحرك بحرية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن توسيع إمكانات هذا المجهر من خلال تحسين الدقة الزمنية للتصوير ودمجها مع البروتينات الفلورية الحساسة للجهد33.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال المنح في المعونة للبحث العلمي في المجالات المبتكرة (19H04753 ، 19H05219 ، و 25110732 إلى H. W.) ، المنح في المعونة لمجالات البحث التحويلي (A) (20H05899 إلى H. W. ، 20H05886 إلى OM ، و 21H05587 إلى D. K.) ، تعزيز البحث الدولي المشترك (B) (20KK0170 إلى H. W.) ، منحة في المعونة للبحث العلمي (B) (18H02598 إلى H. W.) ، منحة في المعونة للبحث العلمي (A) (21H04663 إلى O. M.) ، منحة في المعونة للعلماء في بداية حياتهم المهنية (20K15193 إلى X. Q.) ، رقم منحة JST CREST JPMJCR1755 ، اليابان ، ورقم منحة JST A-STEP JPMJTR204C.
Materials
| 25x Objective | Nikon | N25X-APO-MP | Objective |
| A1MP | Nikon | A1MP | Microscope |
| AnesII | Bio machinery | AnesII | Anesthesia delivery system |
| C2 plus | Nikon | C2 plus | Microscope |
| DECADRON Phosphate Injection | Aspen | 21N024 | Avoid cerebral edema |
| Dental Drill | Jota | C1.HP.005 | Dental drill |
| Electric Microinjector | NARISHIGE | IM-31 | Pressure injection system |
| FEATHERS | FEARGER | FA-10 | Shaving |
| G-CEM ONE ADHESIVE ENHANCING PRIMER | GC | 2110271 | Resin cement primer for dental adhesion |
| G-CEM ONE neo | GC | 43093 | Resin cement for dental adhesion |
| Glass Capillary with Filament | NARISHIGE | GDC-1 | Glass capillary |
| Image Detector | Hamamatsu | H10770PA-40 | GaAsP photocathode photomultiplier tube |
| Imaging Software | Nikon | NISelements | Imaging software |
| Isoflurane Inhalation Solution | Pfizer | 229KAR | Anesthetics |
| iXon EMCCD Camera | Andor | iXon Life 888 | Image sensor |
| Ketamine | daiitisannkyou | s9-018506 | Anesthetics |
| Leica-M60 | Leica | M60 | Stereoscope |
| Linicon | Linicon | LV-125 | Vacuum pump |
| Mode-locked Ti:sapphire Chameleon Ultra II laser | Coherent | Chameleon Discovery NX | Femtosecond laser |
| Mos-Cure | U-VIX | mini 365 | Portable LED UV Light Source |
| PEN Bright | SHOFU INC. | PEN Bright | Dental light curing unit |
| Puller | SUTTER instaument | P-97 | Puller |
| Stereotaxic Instrument (for Mice) | NARISHIGE | SR-6M-H | Stereotaxic instrument |
| Stereotaxic Micromanipulator | NARISHIGE | SM-15R | Stereotaxic micromanipulator |
| Super-Bond CATALYST V | SUN MEDICAL | 8070 | Dental adhesive resin cement |
| Super-Bond Dental Adhesive Monomer | SUN MEDICAL | 8071 | Dental adhesive monomer |
| Super-Bond Teeth Color Polymer Powder | SUN MEDICAL | 145052000 | Teeth color polymer powder |
| Tarivid Ophthalmic Ointment 0.3% | Santen Pharmaceutical | TRN3952 | Eye ointment |
| UlTIMATE XL | NSK | Y141446 | Dental laboratory micromotor control unit |
| UV Curing Optical Adhesives | THORLABS | NOA61 | UV Curing Optical Adhesives |
| Xylazine | Bayer | KP0F2BK | Anesthetics |
Referências
- Masamizu, Y., et al. Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task. Nature Neuroscience. 17 (7), 987-994 (2014).
- Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
- Kato, D., et al. Motor learning requires myelination to reduce asynchrony and spontaneity in neural activity. Glia. 68 (1), 193-210 (2020).
- Busche, M. A., et al. Tau impairs neural circuits, dominating amyloid-β effects, in Alzheimer models in vivo. Nature Neuroscience. 22 (1), 57-64 (2019).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Quan, X., Kato, D., Daria, V., Matoba, O., Wake, H. Holographic microscope and its biological application. Neuroscience Research. 179, 57-64 (2022).
- Adesnik, H., Abdeladim, L. Probing neural codes with two-photon holographic optogenetics. Nature Neuroscience. 24 (10), 1356-1366 (2021).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).
- Carrillo-Reid, L., Han, S., Yang, W., Akrouh, A., Yuste, R. Controlling visually guided behavior by holographic recalling of cortical ensembles. Cell. 178 (2), 447-457 (2019).
- Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
- Gill, J. V., et al. Precise holographic manipulation of olfactory circuits reveals coding features determining perceptual detection. Neuron. 108 (2), 382-393 (2020).
- Robinson, N. T. M., et al. Targeted activation of hippocampal place cells drives memory-guided spatial behavior. Cell. 183 (6), 1586-1599 (2020).
- Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Häusser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
- Mardinly, A. R., et al. Precise multimodal optical control of neural ensemble activity. Nature Neuroscience. 21 (6), 881-893 (2018).
- Yang, W., Carrillo-Reid, L., Bando, Y., Peterka, D. S., Yuste, R. Simultaneous two-photon imaging and two-photon optogenetics of cortical circuits in three dimensions. Elife. 7, 32671 (2018).
- Forli, A., et al. Two-photon bidirectional control and imaging of neuronal excitability with high spatial resolution in vivo. Cell Reports. 22 (11), 3087-3098 (2018).
- Pégard, N. C., et al. Three-dimensional scanless holographic optogenetics with temporal focusing (3D-SHOT). Nature Communications. 8 (1), 1228 (2017).
- Dal Maschio, M., Donovan, J. C., Helmbrecht, T. O., Baier, H. Linking neurons to network function and behavior by two-photon holographic optogenetics and volumetric imaging. Neuron. 94 (4), 774-789 (2017).
- Russell, L. E., et al. All-optical interrogation of neural circuits in behaving mice. Nature Protocols. 17 (7), 1579-1620 (2022).
- Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).
- Hernandez, O., et al. Three-dimensional spatiotemporal focusing of holographic patterns. Nature Communications. 7, 11928 (2016).
- Okada, T., et al. Pain induces stable, active microcircuits in the somatosensory cortex that provide a therapeutic target. Science Advances. 7 (12), 8261 (2021).
- Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
- Gonçalves, J. T., Anstey, J. E., Golshani, P., Portera-Cailliau, C. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
- Akiyoshi, R., et al. Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization. eNeuro. 5 (5), (2018).
- Haruwaka, K., et al. Dual microglia effects on blood brain barrier permeability induced by systemic inflammation. Nature Communications. 10 (1), 5816 (2019).
- Kishi, K. E., et al. Structural basis for channel conduction in the pump-like channelrhodopsin ChRmine. Cell. 185 (4), 672-689 (2022).
- Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Ko, H., et al. The emergence of functional microcircuits in visual cortex. Nature. 496 (7443), 96-100 (2013).
- Zong, W., et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell. 185 (7), 1240-1256 (2022).
- Villette, V., et al. ultrafast two-photon imaging of a high-gain voltage indicator in awake behaving mice. Cell. 179 (7), 1590-1608 (2019).
