Vi utviklet et to-foton holografisk mikroskop som kan visualisere, vurdere og manipulere nevral aktivitet ved hjelp av høy spatiotemporal oppløsning, med sikte på å belyse patogenesen av nevropsykiatriske lidelser som er forbundet med unormal nevral aktivitet.
Nylige fremskritt innen optisk bioimaging og optogenetikk har muliggjort visualisering og manipulering av biologiske fenomener, inkludert cellulære aktiviteter, hos levende dyr. Innen nevrovitenskap har detaljert nevral aktivitet relatert til hjernefunksjoner, som læring og minne, nå blitt avslørt, og det har blitt mulig å kunstig manipulere denne aktiviteten for å uttrykke hjernefunksjoner. Imidlertid har den konvensjonelle evalueringen av nevral aktivitet ved to-foton Ca2+ avbildning problemet med lav temporal oppløsning. I tillegg kan manipulering av nevral aktivitet ved konvensjonell optogenetikk gjennom optisk fiber bare samtidig regulere aktiviteten til nevroner med samme genetiske bakgrunn, noe som gjør det vanskelig å kontrollere aktiviteten til individuelle nevroner. For å løse dette problemet har vi nylig utviklet et mikroskop med høy spatiotemporal oppløsning for biologiske applikasjoner ved å kombinere optogenetikk med digital holografisk teknologi som kan modifisere femtosekund infrarøde laserstråler. Her beskriver vi protokoller for visualisering, evaluering og manipulering av nevral aktivitet, inkludert fremstilling av prøver og drift av et to-foton holografisk mikroskop (figur 1). Disse protokollene gir nøyaktig spatiotemporal informasjon om nevral aktivitet, noe som kan være nyttig for å belyse patogenesen av nevropsykiatriske lidelser som fører til abnormiteter i nevral aktivitet.
To-foton Ca2+ avbildning er en nyttig teknikk for vurdering av nevral aktivitet. Det kan brukes til å identifisere ikke bare nevral aktivitet som kreves for atferd og minne hos normale dyr1,2, men også en unormal nevronaktivitet som oppstår i musemodeller av nevropsykiatriske lidelser 3,4. Teknikken har blitt brukt til å belyse det nevrale grunnlaget for hjernefunksjoner. Men selv om det kan gi bilder med høy oppløsning og høy kvalitet, er den tidsmessige oppløsningen lavere enn den elektrofysiologiske metoden 1,3.
Optogenetikk har bidratt til å innovere måten nevrologer forstår hjernefunksjon5. Gitt de tekniske begrensningene har flertallet av optogenetisk forskning brukt aktiveringsordninger med lav romlig oppløsning, og dermed begrenset hvilke typer manipulasjoner av nevral aktivitet som kan utføres tilsvarende. Imidlertid kan manipulering av nevral aktivitet på finere spatiotemporale skalaer potensielt være nyttig for en mer fullstendig forståelse av nevrale beregninger og patogenesen av nevropsykiatriske lidelser. Romlig presis holografisk teknologi som kan forme femtosekund nær infrarøde laserstråler lover å overvinne denne utfordringen og åpner for flere nye eksperimentelle klasser som tidligere var umulige 6,7. Denne teknologien gjør det mulig for nevrologer å avdekke de grunnleggende aspektene og patologiene til sensoriske, kognitive og atferdsmessige nevrale koder som har vært utenfor rekkevidde.
Holografisk projeksjon innebærer generering av ønskede lysmønstre for å få tilgang til individuelle celler og funksjonelle nettverk selektivt. In vivo-eksperimenter krever optimal lysoverføring for å målrette celler i den levende hjernen. Infrarødt lys trenger dypere inn i levende vev og kan brukes til ikke-lineær to-foton eksitasjon (2PE)8,9,10. Dermed kan to-foton holografisk mikroskopi, som kombinerer holografisk projeksjon og 2PE, brukes til å evaluere og manipulere nevrale aktiviteter for å undersøke cellulære og funksjonelle nettverk in vivo. Nylige biologiske anvendelser av to-foton holografisk mikroskopi har belyst nevral aktivitet og kretsløp som kreves for læring i den visuelle cortex 11,12, olfaktorisk pære13 og hippocampus14.
Tallrike laboratorier over hele verden har rapportert spennende resultater og forbedringer ved hjelp av deres holografiske stimuleringssystemer 15,16,17,18,19,20,21,22,23. I systemet beskrevet her kan det holografiske stimuleringssystemet bygges som en tilleggsanordning for et konvensjonelt mikroskop. Den fasebaserte romlige lysmodulatoren (SLM) er nøkkelenheten for å modulere en planbølgefront til enhver form, og interferenseffekten brukes til å kontrollere intensiteten og plasseringen av foci. Figur 2 viser holografisk stimulering og avbildning av lysbaner. Den første lysbanen er for punktskanningsmodus og består av et skannehode og bildedetektorer. Den andre lysbanen er for holografisk stimulering med en bølgelengde på 1040 nm og består av en SLM1. Den tredje lysbanen er for holografisk belysning med 920 nm bølgelengde og består av en SLM2 og en bildesensor. Den holografiske bildemodusen kan registrere intensiteter fra flere interesseområder ved å belyse flere punkter i prøven. På denne måten kan opptakshastigheten økes til noen hundre bilder per sekund. For å oppnå punktskanning eller holografisk belysningsavbildning ble 920 nm laseren delt inn i to baner av en strålesplitter med et fast forhold på 3: 7. Alle de optiske elementene ble justert på en optisk brødfjøl med dimensjoner på 600 mm × 600 mm. Det modulerte lyset kom inn gjennom lysporten på siden av det mikroskopiske legemet, mens punktskanningslyset kom inn gjennom skannehodet på toppen av det mikroskopiske legemet. Disse lysene ble integrert like over objektivlinsen og skapte foci i prøveplanet. I tillegg gjorde den skreddersydde programvaren det mulig for den vanlige arbeidsflyten å være enkel og konsistent.
I denne artikkelen presenteres en komplett protokoll for bruk av holografisk stimulering eller belysning for å måle nevral aktivitet og vurdere funksjonell tilkobling mellom nevroner. For demonstrasjonsformål beskriver vi her en hjernekirurgi rettet mot bakkroppsområdet av den primære somatosensoriske cortex (S1HL) i musehjernen og en metode for å vurdere og manipulere nevral aktivitet ved hjelp av to-foton holografisk mikroskopi. Den eksperimentelle prosedyren er delt inn i fire deler. Først ble hodeplaten festet til musens skalle ved hjelp av tannsement. For det andre ble en viral vektor som uttrykker jGCaMP8f eller GCaMP6m-P2A-ChRmine stereotaktisk injisert i S1HL. For det tredje ble det holografiske stimulerings- eller belysningssystemet kalibrert. For det fjerde, etter postoperativ gjenoppretting og ekspresjon av disse to proteinene, ble in vivo Ca2+ avbildning utført for å vurdere nevral aktivitet og funksjonell tilkobling mellom nevroner med to-foton holografisk mikroskopi.
For å forstå hjernens funksjon, er det nødvendig å nøyaktig vurdere nevrale kretsløp som ligger til grunn for hjernefunksjonen ved å trekke ut dynamikken i nevral aktivitet. Videre er det viktig å identifisere hvordan denne nevrale kretsen endres for å belyse patogenesen av nevropsykiatriske lidelser. Faktisk er det kjent at nevral aktivitet er forhøyet i musemodeller av Alzheimers sykdom4 og fragilt X-syndrom26 og mus med nedsatt hvit materiefunksjon3. Videre, i en musemodell av inflammatorisk smerte, er økt synkronisering av nevral aktivitet og funksjonell tilkobling mellom nevroner forbundet med symptomer24. To-foton holografisk mikroskopi tillater oss samtidig å observere aktiviteten til individuelle nevroner og de funksjonelle forbindelsene mellom nevroner, noe som er nødvendig for å forstå nevrale kretser. Vi brukte en 25x objektivlinse med numerisk blenderåpning = 1,1 med bølgelengder på 1,040 nm. Den teoretiske punktspredningsfunksjonen er en gaussisk fordeling med full bredde ved maksimalt 0,5 μm lateralt og 1,7 μm aksialt. Den faktiske numeriske blenderåpningen er imidlertid mindre enn 1,1, og den målte punktstørrelsen på en fluorescensperle er 1,2 μm lateralt og 8,3 μm aksialt. Gitt at nevrondiameteren er ca. 15 μm og kalibreringsfeilen er innenfor 3 μm, er målrettingen generelt god. Celler i aksial retning kan imidlertid påvirkes av den lengre punktstørrelsen6. Her beskrev vi virusinjeksjon, kirurgi, kalibrering av holografiske stimulerings- eller belysningssystemer og bildeprotokoller for evaluering og manipulering av nevral aktivitet hos levende mus ved hjelp av vårt mikroskopisystem.
Det tar 2-4 uker å fullføre alle eksperimentelle prosedyrer, fra hodeplateimplantasjon og virusinjeksjon til datainnsamling for in vivo Ca2+ avbildning ved hjelp av holografisk mikroskopi. Prosessen er kompleks og arbeidskrevende, og eksperimentets endelige suksess avhenger av flere faktorer, inkludert tilstanden til kranialvinduet, som påvirkes av postoperativ betennelse, riktig valg av Ca2+ indikator og opsin, og om bevegelsesartefakter i de oppkjøpte bildene kan korrigeres. Spesielt to trinn er viktige for et vellykket resultat. Den første gjelder hodeplatefiksering og kirurgi; Det er avgjørende at hodeplaten festes godt til musehodet med tannsement. Videre er det viktig å gjentatte ganger rengjøre beinfragmenter og koagulert blod ved hjelp av kald ACSF under operasjonen. Siden overholdelse av denne prosedyren reduserer betennelse, observerte vi vellykket dynamikken til mikroglia, cellene som er ansvarlige for hjernens immunsystem, uten å aktivere sine prosesser og spines eller mikrostrukturer av nevroner27,28. Det andre problemet er evaluering og manipulering av nevral aktivitet. Vi valgte AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1 for å uttrykke Ca2+-indikatoren og opsin i ett nevron samtidig. Dette fordi det er vanskelig å infisere ett nevron med ulike AAV-typer på en effektiv måte. En annen grunn til dette valget var at ChRmine effektivt kan aktivere nevral aktivitet ved 1,040 nm ved hjelp av en to-foton laser12. Nylig har det blitt rapportert at ChRmine, ved å mutere sin struktur basert på strukturell informasjon oppnådd ved kryo-elektronmikroskopi, forbedrer sin funksjon29, som anses som nyttig for målfunksjonsanalyse innen nevrovitenskap. I lys av disse problemene er det nødvendig å dele effektive metoder for å evaluere og manipulere nevroner når du leser nevral aktivitet og skriver informasjon ved hjelp av holografisk mikroskopi.
Nylige fremskritt innen bildebehandling og optogenetikk har avslørt den detaljerte nevrale aktiviteten som er involvert i hjernefunksjoner som læring og minne, og det er mulig å kunstig manipulere denne nevrale aktiviteten for å uttrykke hjernefunksjoner30. Imidlertid er konvensjonelle metoder for manipulering av nevral aktivitet svært invasive på grunn av innsetting av optiske fibre i hjernen og fordi en gruppe opsinuttrykkende celler samtidig stimuleres, noe som gjør det umulig å manipulere nevral aktivitet med tidsmessig og romlig presisjon. Vår metode kan manipulere nevral aktivitet ved å stimulere bare spesifikke nevroner i hjernen, og dermed muliggjøre manipulering av nevral aktivitet med spesifikke stimuleringsmønstre og høy spatiotemporal oppløsning. Videre er det viktig å merke seg at funksjonell tilkobling mellom nevroner bare kan evalueres i et lite antall nevroner ved hjelp av hjerneskiveeksperimenter31; Imidlertid tillater denne teknikken samtidig evaluering av flere nevroner i levende dyr.
En av de største begrensningene i dagens holografiske mikroskoper er behovet for å fikse musehodet, noe som begrenser musens oppførsel. Nylig ble det utviklet et miniatyrisert to-foton mikroskop32, og med den videre miniatyriseringen av enheten kan in vivo Ca2+ avbildning med holografisk stimulering være mulig i frittbevegelige mus. I tillegg kan potensialet til dette mikroskopet utvides ved å forbedre den tidsmessige oppløsningen av bildebehandling og kombinere den med svært følsomme spenningsfølsomme fluorescerende proteiner33.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Grants-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (19H04753, 19H05219 og 25110732 til HW), Grants-in-Aid for Transformative Research Areas (A) (20H05899 til HW, 20H05886 til O. M., og 21H05587 til D. K.), Fostering Joint International Research (B) (20KK0170 til H. W.), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (18H02598 til HW), Grant-in-Aid for Scientific Research (A) (21H04663 til O. M.), Grant-in-aid for forskere tidlig i karrieren (20K15193 til X. Q.), JST CREST Grant Number JPMJCR1755, Japan, og JST A-STEP Grant Number JPMJTR204C.
25x Objective | Nikon | N25X-APO-MP | Objective |
A1MP | Nikon | A1MP | Microscope |
AnesII | Bio machinery | AnesII | Anesthesia delivery system |
C2 plus | Nikon | C2 plus | Microscope |
DECADRON Phosphate Injection | Aspen | 21N024 | Avoid cerebral edema |
Dental Drill | Jota | C1.HP.005 | Dental drill |
Electric Microinjector | NARISHIGE | IM-31 | Pressure injection system |
FEATHERS | FEARGER | FA-10 | Shaving |
G-CEM ONE ADHESIVE ENHANCING PRIMER | GC | 2110271 | Resin cement primer for dental adhesion |
G-CEM ONE neo | GC | 43093 | Resin cement for dental adhesion |
Glass Capillary with Filament | NARISHIGE | GDC-1 | Glass capillary |
Image Detector | Hamamatsu | H10770PA-40 | GaAsP photocathode photomultiplier tube |
Imaging Software | Nikon | NISelements | Imaging software |
Isoflurane Inhalation Solution | Pfizer | 229KAR | Anesthetics |
iXon EMCCD Camera | Andor | iXon Life 888 | Image sensor |
Ketamine | daiitisannkyou | s9-018506 | Anesthetics |
Leica-M60 | Leica | M60 | Stereoscope |
Linicon | Linicon | LV-125 | Vacuum pump |
Mode-locked Ti:sapphire Chameleon Ultra II laser | Coherent | Chameleon Discovery NX | Femtosecond laser |
Mos-Cure | U-VIX | mini 365 | Portable LED UV Light Source |
PEN Bright | SHOFU INC. | PEN Bright | Dental light curing unit |
Puller | SUTTER instaument | P-97 | Puller |
Stereotaxic Instrument (for Mice) | NARISHIGE | SR-6M-H | Stereotaxic instrument |
Stereotaxic Micromanipulator | NARISHIGE | SM-15R | Stereotaxic micromanipulator |
Super-Bond CATALYST V | SUN MEDICAL | 8070 | Dental adhesive resin cement |
Super-Bond Dental Adhesive Monomer | SUN MEDICAL | 8071 | Dental adhesive monomer |
Super-Bond Teeth Color Polymer Powder | SUN MEDICAL | 145052000 | Teeth color polymer powder |
Tarivid Ophthalmic Ointment 0.3% | Santen Pharmaceutical | TRN3952 | Eye ointment |
UlTIMATE XL | NSK | Y141446 | Dental laboratory micromotor control unit |
UV Curing Optical Adhesives | THORLABS | NOA61 | UV Curing Optical Adhesives |
Xylazine | Bayer | KP0F2BK | Anesthetics |