Vi utvecklade ett tvåfotonholografiskt mikroskop som kan visualisera, bedöma och manipulera neural aktivitet med hög spatiotemporal upplösning, i syfte att belysa patogenesen av neuropsykiatriska störningar som är förknippade med onormal neural aktivitet.
Nya framsteg inom optisk bioimaging och optogenetik har möjliggjort visualisering och manipulation av biologiska fenomen, inklusive cellulära aktiviteter, hos levande djur. Inom neurovetenskap har detaljerad neural aktivitet relaterad till hjärnfunktioner, såsom inlärning och minne, nu avslöjats, och det har blivit möjligt att artificiellt manipulera denna aktivitet för att uttrycka hjärnfunktioner. Den konventionella utvärderingen av neural aktivitet med tvåfotons Ca2+ -avbildning har emellertid problemet med låg tidsupplösning. Dessutom kan manipulation av neural aktivitet genom konventionell optogenetik genom optisk fiber endast samtidigt reglera aktiviteten hos neuroner med samma genetiska bakgrund, vilket gör det svårt att kontrollera aktiviteten hos enskilda neuroner. För att lösa detta problem utvecklade vi nyligen ett mikroskop med hög spatiotemporal upplösning för biologiska tillämpningar genom att kombinera optogenetik med digital holografisk teknik som kan modifiera femtosekund infraröda laserstrålar. Här beskriver vi protokoll för visualisering, utvärdering och manipulation av neural aktivitet, inklusive beredning av prover och drift av ett tvåfotonholografiskt mikroskop (figur 1). Dessa protokoll ger korrekt spatiotemporal information om neural aktivitet, vilket kan vara användbart för att belysa patogenesen av neuropsykiatriska störningar som leder till abnormiteter i neural aktivitet.
Tvåfotoner Ca2+ avbildning är en användbar teknik för bedömning av neural aktivitet. Det kan användas för att identifiera inte bara den neurala aktivitet som krävs för beteende och minne hos normala djur1,2 utan också en onormal neuronal aktivitet som förekommer i musmodeller av neuropsykiatriska störningar 3,4. Tekniken har använts för att belysa den neurala grunden för hjärnfunktioner. Men även om den kan ge högupplösta och högkvalitativa bilder är dess tidsupplösning lägre än den elektrofysiologiska metoden 1,3.
Optogenetik har hjälpt till att förnya hur neuroforskare förstår hjärnans funktion5. Med tanke på de tekniska begränsningarna har majoriteten av optogenetisk forskning använt aktiveringsscheman med låg rumslig upplösning, vilket begränsar de typer av manipuleringar av neural aktivitet som kan utföras i enlighet därmed. Att manipulera neural aktivitet på finare spatiotemporala skalor kan dock potentiellt vara användbart för en mer fullständig förståelse av neurala beräkningar och patogenesen av neuropsykiatriska störningar. Rumsligt exakt holografisk teknik som kan forma femtosekund nära infraröda laserstrålar lovar att övervinna denna utmaning och öppnar flera nya experimentella klasser som tidigare var omöjliga 6,7. Denna teknik gör det möjligt för neuroforskare att avslöja de grundläggande aspekterna och patologierna av sensoriska, kognitiva och beteendemässiga neurala koder som har varit utom räckhåll.
Holografisk projektion innebär generering av önskade ljusmönster för att komma åt enskilda celler och funktionella nätverk selektivt. In vivo-experiment kräver optimal ljusöverföring till målceller i den levande hjärnan. Infrarött ljus tränger djupare in i levande vävnad och kan användas för icke-linjär tvåfotonexcitation (2PE)8,9,10. Således kan tvåfotonholografisk mikroskopi, som kombinerar holografisk projektion och 2PE, användas för att utvärdera och manipulera neurala aktiviteter för att undersöka cellulära och funktionella nätverk in vivo. Nya biologiska tillämpningar av tvåfotonholografisk mikroskopi har belyst den neurala aktiviteten och kretsarna som krävs för inlärning i visuell cortex 11,12, luktlampa13 och hippocampus14.
Många laboratorier världen över har rapporterat spännande resultat och förbättringar med hjälp av sina holografiska stimuleringssystem 15,16,17,18,19,20,21,22,23. I det system som beskrivs här kan det holografiska stimuleringssystemet byggas som en tilläggsanordning för ett konventionellt mikroskop. Den fas-bara rumsliga ljusmodulatorn (SLM) är nyckelanordningen för att modulera en plan vågfront till vilken form som helst, och interferenseffekten används för att styra intensiteten och placeringen av foci. Figur 2 visar ljusbanor för holografisk stimulering och avbildning. Den första ljusvägen är för punktskanningsläge och består av ett skanningshuvud och bilddetektorer. Den andra ljusvägen är för holografisk stimulering med en våglängd på 1040 nm och består av en SLM1. Den tredje ljusvägen är för holografisk belysning med 920 nm våglängd och består av en SLM2 och en bildsensor. Det holografiska avbildningsläget kan registrera intensiteter från flera intressanta regioner genom att belysa flera punkter i provet. På detta sätt kan inspelningshastigheten ökas till några hundra bilder per sekund. För att uppnå punktskanning eller holografisk belysningsavbildning delades 920 nm-lasern i två banor med en stråldelare med ett fast förhållande på 3: 7. Alla optiska element var inriktade på en optisk brödbräda med dimensioner på 600 mm × 600 mm. Det modulerade ljuset kom in genom ljusporten på sidan av den mikroskopiska kroppen, medan punktskanningsljuset kom in genom skanningshuvudet högst upp på mikroskopkroppen. Dessa lampor integrerades strax ovanför objektivlinsen och skapade foci i provplanet. Dessutom gjorde den skräddarsydda programvaran det vanliga arbetsflödet enkelt och konsekvent.
I denna artikel presenteras ett komplett protokoll för användning av holografisk stimulering eller belysning för att mäta neural aktivitet och bedöma den funktionella anslutningen mellan neuroner. I demonstrationssyfte beskriver vi här en hjärnkirurgi riktad mot bakbensområdet i den primära somatosensoriska cortexen (S1HL) i mushjärnan och en metod för att bedöma och manipulera neural aktivitet med hjälp av tvåfotonholografisk mikroskopi. Det experimentella förfarandet är uppdelat i fyra delar. Först fixerades huvudplattan på musens skalle med tandcement. För det andra injicerades en viral vektor som uttryckte jGCaMP8f eller GCaMP6m-P2A-ChRmine stereotaktiskt i S1HL. För det tredje kalibrerades det holografiska stimulerings- eller belysningssystemet. För det fjärde, efter postoperativ återhämtning och uttryck av dessa två proteiner, utfördes in vivo Ca2+ -avbildning för att bedöma den neurala aktiviteten och funktionella anslutningen mellan neuroner med tvåfotonholografisk mikroskopi.
För att förstå hjärnans funktion är det nödvändigt att noggrant bedöma de neurala kretsarna som ligger till grund för hjärnfunktionen genom att extrahera dynamiken i neural aktivitet. Dessutom är det viktigt att identifiera hur denna neurala krets förändras för att belysa patogenesen av neuropsykiatriska störningar. Det är faktiskt känt att neural aktivitet är förhöjd i musmodeller av Alzheimers sjukdom4 och bräckligt X-syndrom26 och möss med nedsatt vitsubstansfunktion3. Dessutom, i en musmodell av inflammatorisk smärta, är ökad synkronisering av neural aktivitet och funktionell anslutning mellan neuroner associerad med symtom24. Tvåfotonholografisk mikroskopi gör det möjligt för oss att samtidigt observera aktiviteten hos enskilda neuroner och de funktionella kopplingarna mellan neuroner, vilket är nödvändigt för att förstå neurala kretsar. Vi använde en 25x objektivlins med numerisk bländare = 1,1 med våglängder på 1 040 nm. Den teoretiska punktspridningsfunktionen är en gaussisk fördelning med full bredd vid halva maximalt 0,5 μm lateralt och 1,7 μm axiellt. Den faktiska numeriska bländaren är dock mindre än 1,1, och den uppmätta punktstorleken på en fluorescenssträng är 1,2 μm i sidled och 8,3 μm axiellt. Med tanke på att neurondiametern är cirka 15 μm och kalibreringsfelet ligger inom 3 μm är inriktningen generellt bra. Celler i axiell riktning kan dock påverkas av den längre punktstorleken6. Här beskrev vi viral injektion, kirurgi, kalibrering av holografiska stimulerings- eller belysningssystem och avbildningsprotokoll för utvärdering och manipulering av neural aktivitet hos levande möss med hjälp av vårt mikroskopisystem.
Det tar 2-4 veckor att slutföra alla experimentella procedurer, från implantation av huvudplattor och virusinjektion till datainsamling för in vivo Ca2+ avbildning med holografisk mikroskopi. Processen är komplex och mödosam, och experimentets slutliga framgång beror på flera faktorer, inklusive kranialfönstrets tillstånd, som påverkas av postoperativ inflammation, rätt val av Ca2+ indikator och opsin, och om rörelseartefakter i de förvärvade bilderna kan korrigeras. I synnerhet är två steg viktiga för ett framgångsrikt resultat. Den första gäller fixering och kirurgi av huvudplattor; Det är viktigt att huvudplattan är ordentligt fastsatt på mushuvudet med tandcement. Dessutom är det viktigt att upprepade gånger rengöra benfragment och koagulerat blod med kall ACSF under operationen. Eftersom vidhäftning till denna procedur minskar inflammation observerade vi framgångsrikt dynamiken hos microglia, cellerna som är ansvariga för hjärnans immunsystem, utan att aktivera deras processer och spines eller mikrostrukturerna hos neuroner27,28. Den andra frågan är utvärdering och manipulation av neural aktivitet. Vi valde AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1 för att uttrycka Ca2+ indikatorn och opsin i en neuron samtidigt. Detta beror på att det är svårt att effektivt infektera en neuron med olika AAV-typer. En annan anledning till detta val var att ChRmine effektivt kan aktivera neural aktivitet vid 1 040 nm med hjälp av en tvåfotonlaser12. Nyligen har det rapporterats att ChRmine, genom att mutera sin struktur baserat på strukturell information erhållen genom kryoelektronmikroskopi, förbättrar dess funktion29, vilket anses vara användbart för målfunktionsanalys inom neurovetenskap. Mot bakgrund av dessa problem är det nödvändigt att dela effektiva metoder för att utvärdera och manipulera neuroner vid läsning av neural aktivitet och skriva information med hjälp av holografisk mikroskopi.
Nya framsteg inom avbildning och optogenetik har avslöjat den detaljerade neurala aktiviteten som är involverad i hjärnfunktioner som inlärning och minne, och det är möjligt att artificiellt manipulera denna neurala aktivitet för att uttrycka hjärnfunktioner30. Konventionella metoder för manipulation av neural aktivitet är emellertid mycket invasiva på grund av införandet av optiska fibrer i hjärnan och eftersom en grupp opsinuttryckande celler stimuleras samtidigt, vilket gör det omöjligt att manipulera neural aktivitet med tidsmässig och rumslig precision. Vår metod kan manipulera neural aktivitet genom att stimulera endast specifika nervceller i hjärnan, vilket möjliggör manipulation av neural aktivitet med specifika stimuleringsmönster och hög spatiotemporal upplösning. Vidare är det viktigt att notera att funktionell anslutning mellan neuroner endast kan utvärderas i ett litet antal neuroner med hjälp av hjärnskivexperiment31; Denna teknik möjliggör emellertid samtidig utvärdering av flera neuroner hos levande djur.
En av de största begränsningarna i nuvarande holografiska mikroskop är behovet av att fixa mushuvudet, vilket begränsar musens beteende. Nyligen utvecklades ett miniatyriserat tvåfotonmikroskop32, och med ytterligare miniatyrisering av enheten kan in vivo Ca2+ -avbildning med holografisk stimulering vara möjlig i fritt rörliga möss. Dessutom kan potentialen hos detta mikroskop utökas genom att förbättra den tidsmässiga upplösningen av avbildning och kombinera den med mycket känsliga spänningskänsliga fluorescerande proteiner33.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av bidrag till vetenskaplig forskning om innovativa områden (19H04753, 19H05219 och 25110732 till H. W.), Grants-in-Aid for Transformative Research Areas (A) (20H05899 till H. W., 20H05886 till O. M. och 21H05587 till D. K.), Främjande av gemensam internationell forskning (B) (20KK0170 till H. W.), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (18H02598 till H. W.), Grant-in-Aid for Scientific Research (A) (21H04663 till O. M.), Grant-in-Aid for Early-Career Scientists (20K15193 till X. Q.), JST CREST Grant Number JPMJCR1755, Japan, och JST A-STEP Grant Number JPMJTR204C.
25x Objective | Nikon | N25X-APO-MP | Objective |
A1MP | Nikon | A1MP | Microscope |
AnesII | Bio machinery | AnesII | Anesthesia delivery system |
C2 plus | Nikon | C2 plus | Microscope |
DECADRON Phosphate Injection | Aspen | 21N024 | Avoid cerebral edema |
Dental Drill | Jota | C1.HP.005 | Dental drill |
Electric Microinjector | NARISHIGE | IM-31 | Pressure injection system |
FEATHERS | FEARGER | FA-10 | Shaving |
G-CEM ONE ADHESIVE ENHANCING PRIMER | GC | 2110271 | Resin cement primer for dental adhesion |
G-CEM ONE neo | GC | 43093 | Resin cement for dental adhesion |
Glass Capillary with Filament | NARISHIGE | GDC-1 | Glass capillary |
Image Detector | Hamamatsu | H10770PA-40 | GaAsP photocathode photomultiplier tube |
Imaging Software | Nikon | NISelements | Imaging software |
Isoflurane Inhalation Solution | Pfizer | 229KAR | Anesthetics |
iXon EMCCD Camera | Andor | iXon Life 888 | Image sensor |
Ketamine | daiitisannkyou | s9-018506 | Anesthetics |
Leica-M60 | Leica | M60 | Stereoscope |
Linicon | Linicon | LV-125 | Vacuum pump |
Mode-locked Ti:sapphire Chameleon Ultra II laser | Coherent | Chameleon Discovery NX | Femtosecond laser |
Mos-Cure | U-VIX | mini 365 | Portable LED UV Light Source |
PEN Bright | SHOFU INC. | PEN Bright | Dental light curing unit |
Puller | SUTTER instaument | P-97 | Puller |
Stereotaxic Instrument (for Mice) | NARISHIGE | SR-6M-H | Stereotaxic instrument |
Stereotaxic Micromanipulator | NARISHIGE | SM-15R | Stereotaxic micromanipulator |
Super-Bond CATALYST V | SUN MEDICAL | 8070 | Dental adhesive resin cement |
Super-Bond Dental Adhesive Monomer | SUN MEDICAL | 8071 | Dental adhesive monomer |
Super-Bond Teeth Color Polymer Powder | SUN MEDICAL | 145052000 | Teeth color polymer powder |
Tarivid Ophthalmic Ointment 0.3% | Santen Pharmaceutical | TRN3952 | Eye ointment |
UlTIMATE XL | NSK | Y141446 | Dental laboratory micromotor control unit |
UV Curing Optical Adhesives | THORLABS | NOA61 | UV Curing Optical Adhesives |
Xylazine | Bayer | KP0F2BK | Anesthetics |