Kaspaz Mutasyonlarının ve Post-Translasyonel Modifikasyonun Moleküler Modelleme Yaklaşımlarıyla Araştırılması
Summary
Mevcut protokol bir biyomoleküler simülasyon paketi kullanır ve vahşi tip kaspaz ve mutant formlarını modellemek için moleküler dinamik (MD) yaklaşımını açıklar. MD yöntemi, kaspaz yapısının dinamik evrimini ve mutasyonların veya post-translasyonel modifikasyonların potansiyel etkisini değerlendirmeye izin verir.
Abstract
Apoptoz, hasarlı hücreleri ortadan kaldıran ve çok hücreli organizmaların gelişimini ve doku homeostazını kontrol eden bir tür programlanmış hücre ölümüdür. Sistein proteazlarının bir ailesi olan kaspazlar, apoptozun başlatılmasında ve uygulanmasında anahtar rol oynamaktadır. Kaspazların olgunlaşması ve aktiviteleri, son derece dinamik bir şekilde çeviri sonrası modifikasyonlarla ince ayarlanmıştır. Translasyonel sonrası değişikliklerin etkisini değerlendirmek için, potansiyel bölgeler rutin olarak herhangi bir modifikasyona kalıcı kalıntılarla mutasyona uğrar. Örneğin, serin kalıntısı alanin veya aspartik asit ile değiştirilir. Bununla birlikte, bu tür ikameler kaspaz aktif bölgesinin konformasyonunu değiştirebilir ve katalitik aktivite ve hücresel fonksiyonlarda bozulmalara neden olabilir. Ayrıca, kritik pozisyonlarda bulunan diğer amino asit kalıntılarının mutasyonları da kaspazların yapısını ve fonksiyonlarını bozabilir ve apoptoz pertürbasyonuna yol açabilir. Mutasyona uğramış kalıntıların kullanılmasının zorluklarından kaçınmak için, amino asit ikamelerinin kaspaz yapısı üzerindeki potansiyel etkisini tahmin etmek için moleküler modelleme yaklaşımları kolayca uygulanabilir. Mevcut protokol, mutasyonların protein yapısı ve fonksiyonu üzerindeki etkisini test etmek için hem vahşi tip kaspaz hem de mutant formlarının biyomoleküler simülasyon paketi (Amber) ve süper bilgisayar tesisleri ile modellenmesine izin verir.
Introduction
Apoptoz, çok hücreli organizmaların morfogenezini ve doku homeostazını düzenleyen en çok çalışılan hücresel süreçlerden biridir. Apoptoz, ölüm reseptörlerinin aktivasyonu, hücre döngüsü sinyallerindeki bozulma, DNA hasarı, endoplazmik retikulum (ER) stresi ve çeşitli bakteriyel ve viral enfeksiyonlar gibi çok çeşitli dış veya iç uyaranlarla başlatılabilir1. Kaspazlar – anahtar apoptotik oyuncular – geleneksel olarak iki gruba ayrılır: başlatıcılar (kaspaz-2, kaspaz-8, kaspaz-9 ve kaspaz-10) ve efektörler (kaspaz-3, kaspaz-6 ve kaspaz-7), etki alanı yapılarına ve kaspaz kaskadın 2,3’teki yerine bağlı olarak. Hücre ölüm sinyalleri üzerine, başlatıcı kaspazlar, aktif bir enzim oluşturmak için yakınlık kaynaklı dimerizasyonu ve otomatik işlemeyi kolaylaştıran adaptör molekülleri ile etkileşime girer. Efektör kaspazlar, başlatıcı kaspazlar tarafından bölünme yoluyla aktive edilir ve çoklu hücresel substratları parçalayarak aşağı akış yürütme adımlarını gerçekleştirir4.
Başlatıcı ve efektör kaspazların olgunlaşması ve işlevi, translasyonel sonrası modifikasyonun hücre ölümü modülasyonunda vazgeçilmez bir rol oynadığı çok sayıda farklı hücre içi mekanizma tarafından düzenlenir5. Modifiye edici grupların (fosforilasyon, nitrosilasyon, metilasyon veya asetilasyon) veya proteinlerin (ubikitinasyon veya SUMOilasyon) eklenmesi, kaspazların enzimatik aktivitesini veya apoptozu düzenleyen protein konformasyonunu ve stabilitesini değiştirir. Sahaya yönelik mutagenez, potansiyel post-translasyonel modifikasyon bölgelerini araştırmak ve rollerini ayırt etmek için yaygın olarak uygulanmaktadır. Varsayılan bir modifikasyon bölgesi genellikle daha fazla değiştirilemeyen başka bir amino asit ile değiştirilir. Böylece, potansiyel olarak fosforile serin ve treonin, alanine mutasyona uğrar ve lizin ubikitinasyon bölgeleri arginin ile değiştirilir. Başka bir strateji, özellikle post-translasyonel modifikasyonu taklit eden bir amino asidin ikame edilmesini içerir (örneğin, fosforile serin veya treonini taklit etmek için glutamat ve aspartat kullanılmıştır)6. Bununla birlikte, aktif bir bölgenin yüksek çevresinde veya kritik pozisyonlarda bulunan bu ikamelerin bazıları kaspaz yapısını değiştirebilir, katalitik aktiviteyi bozabilir ve apoptotik hücre ölümünü baskılayabilir7. Benzer etkiler, kaspaz genlerinde tümörle ilişkili yanlış anlam mutasyonları vakalarında da gözlenebilir. Örneğin, kaspaz-6’nın tümörle ilişkili mutasyonu – R259H – substrat bağlayıcı cepteki döngülerin konformasyonel değişikliklerine neden oldu ve substratların verimli katalitik döngüsünü azalttı8. Baş ve boyun skuamöz hücreli karsinomunda tanımlanan kaspaz-8’deki G325A amino asit ikamesi, nükleer faktör-kB (NF-kB) sinyallemesinin modülasyonuna yol açan ve tümörigenezi teşvik eden kaspaz-8 aktivitesini engelleyebilir9.
Amino asit ikamelerinin kaspaz yapısı ve fonksiyonu üzerindeki potansiyel etkisini değerlendirmek için moleküler modelleme uygulanabilir. Moleküler dinamik (MD) yaklaşımı, biyomoleküler simülasyon paketi (Amber) kullanılarak vahşi tip kaspaz ve mutant formlarının modellenmesi için bu çalışmada açıklanmıştır. MD yöntemi, mutasyonların ortaya çıkmasını takiben protein yapısının dinamik evrimi hakkında bir fikir verir. Başlangıçta Peter Kollman’ın grubu tarafından geliştirilen Amber paketi, biyomoleküler simülasyonlar için en popüler yazılım araçlarından biri haline geldi10,11,12,13. Bu yazılım iki bölüme ayrılmıştır: (1) AmberTools, sistem hazırlığı (atom tipi atama, hidrojen ve açık su molekülleri ekleme, vb.) ve yörünge analizi için rutin olarak kullanılan programların bir koleksiyonu; ve (2) pmemd simülasyon programı etrafında merkezlenen Amber. AmberTools ücretsiz bir pakettir (ve Amber’in kendisini kurmak için bir ön koşuldur), Amber ise ayrı bir lisans ve ücret yapısı ile dağıtılmaktadır. Bir süper bilgisayarda ve / veya grafik işlem birimleri (GPU’lar) kullanılarak yapılan paralel simülasyonlar, protein yapı dinamiklerinin bilimsel araştırması için performansı önemli ölçüde artırabilir14. Mevcut en son yazılım sürümleri AmberTools21 ve Amber20’dir, ancak açıklanan protokoller eski sürümlerle de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan MD yaklaşımı, biyomoleküler simülasyon paketlerini kullanarak hem vahşi tip hem de mutant kaspaz formlarının modellenmesine izin verir. Metodolojinin birkaç önemli konusu burada tartışılmaktadır. İlk olarak, Protein Veri Bankası’ndan kaspazın temsili bir kristal yapısının seçilmesi gerekir. Önemli olarak, kaspazın hem monomerik hem de dimerik formları kabul edilebilir. Minimum sayıda eksik kalıntı içeren yüksek çözünürlüklü yapıların seçilmesi iyi bir fikirdir. Bazı kal?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Rus Bilim Vakfı’ndan (17-75-20102, protokol geliştirme) bir hibe ile desteklenmiştir. Temsili sonuçlar bölümünde (fosforilasyon analizi) açıklanan deneyler Stockholm (181301) ve İsveç (190345) Kanser Dernekleri tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Amber20 | University of California, San Francisco | Software for molecular dynamics simulation http://ambermd.org |
|
| AmberTools21 | University of California, San Francisco | Software for molecular modeling and analysis http://ambermd.org |
Referências
- Olsson, M., Zhivotovsky, B. Caspases and cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1441-1449 (2011).
- Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspase: Pharmacological manipulation of cell death. Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2665-2672 (2005).
- Degterev, A., Boyce, M., Yuan, J. A decade of caspases. Oncogene. 22 (53), 8543-8567 (2003).
- Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: Activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
- Zamaraev, A. V., Kopeina, G. S., Prokhorova, E. A., Zhivotovsky, B., Lavrik, I. N. Post-translational modification of caspases: The other side of apoptosis regulation. Trends in Cell Biology. 27 (5), 322-339 (2017).
- Pearlman, S. M., Serber, Z., Ferrell, J. E. A mechanism for the evolution of phosphorylation sites. Cell. 147 (4), 934-946 (2011).
- Zamaraev, A. V., et al. Requirement for Serine-384 in Caspase-2 processing and activity. Cell Death and Disease. 11 (10), 825 (2020).
- Dagbay, K. B., Hill, M. E., Barrett, E., Hardy, J. A. Tumor-associated mutations in caspase-6 negatively impact catalytic efficiency. Bioquímica. 56 (34), 4568-4577 (2017).
- Ando, M., et al. Cancer-associated missense mutations of caspase-8 activate nuclear factor-κB signaling. Cancer Science. 104 (8), 1002-1008 (2013).
- Case, D. A., et al. . AMBER 2020. , (2020).
- Salomon-Ferrer, R., Case, D. A., Walker, R. C. An overview of the Amber biomolecular simulation package. WIREs Computational Molecular Science. 3 (2), 198-210 (2013).
- Roe, D. R., Cheatham, T. E. PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).
- Maier, J. A., et al. ff14SB: Improving the accuracy of protein side chain and backbone parameters from ff99SB. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).
- Salomon-Ferrer, R., Götz, A. W., Poole, D., Le Grand, S., Walker, R. C. Routine microsecond molecular dynamics simulations with AMBER on GPUs. 2. Explicit solvent particle mesh ewald. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (9), 3878-3888 (2013).
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Burley, S. K., et al. RCSB Protein Data Bank: Powerful new tools for exploring 3D structures of biological macromolecules for basic and applied research and education in fundamental biology, biomedicine, biotechnology, bioengineering and energy sciences. Nucleic Acids Research. 49, 437-451 (2021).
- Martinez, X., et al. Molecular graphics: Bridging structural biologists and computer scientists. Structure. 27 (11), 1617-1623 (2019).
- Lee, T. S., et al. GPU-accelerated molecular dynamics and free energy methods in Amber18: Performance enhancements and new features. Journal of Chemical Information and Modeling. 58 (10), 2043-2050 (2018).
- Jäger, R., Zwacka, R. M. The enigmatic roles of caspases in tumor development. Cancers. 2 (4), 1952-1979 (2010).
