Modellering van hersenmetastase door interne halsslagaderinjectie van kankercellen

Summary

Hersenmetastase is een oorzaak van ernstige morbiditeit en mortaliteit bij kankerpatiënten. De meeste muismodellen voor hersenmetastasen worden gecompliceerd door systemische metastasen die de analyse van mortaliteit en therapeutische interventie-uitkomsten verstoren. Hier gepresenteerd is een protocol voor interne carotisinjectie van kankercellen dat consistente intracraniale tumoren produceert met minimale systemische tumoren.

Abstract

Hersenmetastase is een oorzaak van ernstige morbiditeit en mortaliteit bij kankerpatiënten. Kritische aspecten van gemetastaseerde ziekten, zoals de complexe neurale micro-omgeving en stromale celinteractie, kunnen niet volledig worden gerepliceerd met in vitro assays; diermodellen zijn dus van cruciaal belang voor het onderzoeken en begrijpen van de effecten van therapeutische interventie. De meeste xenotransplantatiemethoden voor hersentumoren produceren echter niet consistent hersenmetastasen in termen van het tijdsbestek en de tumorlast. Hersenmetastasemodellen gegenereerd door intracardiale injectie van kankercellen kunnen leiden tot onbedoelde extracraniële tumorbelasting en leiden tot niet-hersenmetastase morbiditeit en mortaliteit. Hoewel intracraniale injectie van kankercellen de extracraniële tumorvorming kan beperken, heeft het verschillende kanttekeningen, zoals de geïnjecteerde cellen vormen vaak een enkelvoudige tumormassa op de injectieplaats, hoge leptomeningeale betrokkenheid en schade aan de vasculatuur van de hersenen tijdens naaldpenetratie. Dit protocol beschrijft een muismodel van hersenmetastasen gegenereerd door interne halsslagaderinjectie. Deze methode produceert intracraniale tumoren consequent zonder de betrokkenheid van andere organen, waardoor de evaluatie van therapeutische middelen voor hersenmetastase mogelijk wordt.

Introduction

Hersenmetastase is een veel voorkomende maligniteit geassocieerd met een zeer slechte prognose ^1,2. De standaardzorg voor patiënten met hersenmetastase is multimodaal, bestaande uit neurochirurgie, radiotherapie van de hele hersenen en / of stereotactische radiochirurgie, afhankelijk van de algemene gezondheidstoestand van de patiënt, extracraniële ziektelast en het aantal en de locatie van tumoren in de hersenen ^3,4. Patiënten met maximaal drie intracraniale laesies komen in aanmerking voor chirurgische resectie of stereotactische radiochirurgie, terwijl bestralingstherapie van de hele hersenen wordt aanbevolen voor patiënten met meerdere laesies om het risico op operatiegerelateerde infectie en oedeem te voorkomen⁵. Radiotherapie van de hele hersenen kan echter schade toebrengen aan radiogevoelige hersenstructuren, wat bijdraagt aan een slechte kwaliteit van leven⁶.

Systemische therapie is een niet-invasieve alternatieve en logische benadering voor de behandeling van patiënten met meerdere laesies⁷. Het wordt echter minder overwogen vanwege het al lang bestaande idee dat systemische therapieën een slechte werkzaamheid hebben omdat de passieve toediening van cytotoxische geneesmiddelen via de bloedbaan geen therapeutische niveaus in de hersenen kan bereiken zonder het risico op onveilige toxiciteit⁸. Dit paradigma begint te veranderen met de onlangs door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurde systemische therapie (tucatinib met trastuzumab en capecitabine geïndiceerd voor gemetastaseerde HER2 + borstkanker hersenmetastase)9,10,11,12 en de update in behandelingsrichtlijnen om rekening te houden met systemische therapieopties voor hersenmetastasen patiënten ^13,14.

In deze context kunnen ontwikkelingen op het gebied van moleculaire gerichte therapie, immunotherapie en alternatieve toedieningssystemen voor geneesmiddelen, zoals een gerichte nanogeneesmiddeldrager, mogelijk de uitdagingen van de behandeling van hersenmetastasen overwinnen 15,16,17,18. Daarnaast worden ook chemische en mechanische benaderingen onderzocht om de medicijnafgifte te verbeteren via permeabilisatie van de hersentumorbarrière^19,20. Om dergelijke benaderingen te bestuderen en te optimaliseren om geschikt te zijn voor het doel, is het cruciaal om preklinische modellen te gebruiken die niet alleen de complexe fysiologie van hersenmetastase weerspiegelen, maar ook een objectieve analyse van intracraniale geneesmiddelrespons mogelijk maken.

In grote lijnen omvatten de huidige benaderingen om hersenmetastasen in vivo te modelleren intracardiale (linker ventrikel), intraveneuze (meestal staartader), intracraniale of intracarotis (gemeenschappelijke halsslagader) injectie van kankercellen bij muizen 21,22,23,24,25,26,27 . Afgezien van tumortransplantatiestrategieën, zijn genetisch gemanipuleerde muismodellen waarbij tumorvorming wordt geactiveerd door de verwijdering van tumorsuppressorgenen of activering van oncogenen nuttig voor tumormodellering. Er wordt echter gemeld dat slechts een paar genetisch gemanipuleerde muismodellen secundaire tumoren produceren en nog minder die betrouwbaar hersenmetastasen produceren 28,29,30.

Engraftmentmethoden zoals intracardiale (linker ventrikel) en intraveneuze (meestal staartader) injectie bootsen de systemische verspreiding van kanker na. Deze modellen produceren meestal laesies in meerdere organen (bijv. Hersenen, longen, lever, nieren, milt), afhankelijk van het capillaire bed dat de meeste tumorcellen gevangen houdt tijdens hun circulerende ‘first ^pass’31. Inconsistente snelheden van hersentransplantatie zullen echter meer dieren vereisen om de steekproefgrootte voor de gewenste statistische kracht te bereiken. Het aantal tumorcellen dat zich uiteindelijk via deze intracardiale en intraveneuze injectiemethoden in de hersenen nestelt, is variabel. Vandaar dat de tumorlast van hersenmetastase kan variëren tussen dieren en het verschil in progressie kan het standaardiseren van de experimentele tijdlijn en interpretatie van resultaten een uitdaging maken. De extracraniële tumorlast kan leiden tot niet-hersenmetastasesterfte, waardoor deze modellen ongeschikt zijn voor het evalueren van intracraniale werkzaamheid. Hersentropencellijnen zijn vastgesteld met behulp van kunstmatige klonale selectieprocessen om extracraniële vestiging te verminderen, maar de opnamesnelheden zijn inconsistent geweest en het klonale selectieproces kan de heterogeniteit verminderen die normaal wordt aangetroffen in menselijke tumoren³².

Hersenspecifieke engraftmentmethoden zoals de intracraniale en intracarotide-injectie zorgen voor een consistentere en efficiëntere modellering van hersenmetastase. In de intracraniale methode³³ worden kankercellen meestal geïnjecteerd in de frontale hersenschors, die een snelle en reproduceerbare tumoruitgroei genereert met een lage systemische betrokkenheid. Hoewel de procedure goed wordt verdragen met een lage mortaliteit³³, zijn de kanttekeningen dat het een relatief ruwe benadering is die snel een (gelokaliseerde) bolus van cellen in de hersenen introduceert en geen vroege pathogenese van hersenmetastase modelleert. De naald beschadigt de vasculatuur van hersenweefsel, wat vervolgens een gelokaliseerde ontsteking veroorzaakt ^5,34. Uit ervaring is er een tendens voor tumorcelinjectaat tot reflux tijdens het verwijderen van de naald, wat leidt tot leptomeningeale betrokkenheid. Als alternatief levert de intracarotidemethode cellen in de gemeenschappelijke halsslagader met hersenmicrovasculatuur als het eerste capillaire bed dat wordt aangetroffen, waarbij overleving in circulatie, extravasatie en kolonisatie wordt gemodelleerd²⁴. In overeenstemming met anderen²⁵, bleek uit onze ervaring met deze methode dat het kan resulteren in gezichtstumoren als gevolg van onbedoelde afgifte van kankercellen via de externe halsslagader naar capillaire bedden in deze weefsels (ongepubliceerde gegevens). Het is mogelijk om gezichtstumoren te voorkomen door eerst de uitwendige halsslagader te bruinen voordat de gemeenschappelijke injectie van de halsslagader wordt geadopteerd (figuur 1). In de rest van het artikel wordt deze methode de ‘interne halsslagaderinjectie’ genoemd. Uit ervaring blijkt dat de interne carotisslagaderinjectiemethode consequent hersenmetastasen genereert met zeer weinig systemische gebeurtenissen en succesvol is geweest in het genereren van hersenmetastasemodellen van verschillende primaire kankers (bijv. Melanoom, borst- en longkanker) (figuur 1). De nadelen zijn dat het technisch uitdagend, tijdrovend, invasief is en een zorgvuldige optimalisatie van celaantallen en een monitoringtijdlijn vereist. Samenvattend produceren zowel de intracraniale als de interne carotisslagaderinjectiemethoden muismodellen die geschikt zijn voor het evalueren van de therapeutische impact op het overlevingsvoordeel van hersentumoren.

Dit protocol beschrijft de interne halsslagaderinjectiemethode om een muismodel van hersenmetastase te produceren met bijna geen systemische betrokkenheid en daarom geschikt voor preklinische evaluatie van medicijndistributie en werkzaamheid van experimentele therapieën.

Figuur 1: Schematische weergave van het interne carotisslagaderinjectieprotocol voor hersenmetastasen. Interne halsslagaderinjectie met externe ligatie van de halsslagader kan op betrouwbare wijze een hersenmetastasemodel produceren van verschillende primaire kankers. In dit protocol worden drie ligaturen op de halsslagader geplaatst (geannoteerd als L1-L3 in de figuur). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Alle studies werden uitgevoerd binnen de richtlijnen van de Animal Ethics Committee van de Universiteit van Queensland (UQCCR / 186/19) en de Australian Code for the Care and Use of Animals for Science Purpose. 1. Voorbereiding van kankercellen voor injectie OPMERKING: In deze studie werd de cellijn van menselijke borstkanker, BT-474 (BT474), gebruikt. BT474 werd gekweekt in een volledig groeimedium bestaande uit RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foe…

Representative Results

Vergelijking van gemeenschappelijke injectie van de halsslagader met of zonder ligatie van de uitwendige halsslagaderWanneer kankercellen werden geïnjecteerd via de gemeenschappelijke halsslagader zonder eerst de externe halsslagader te bruinen24, werden gezichtstumoren gevonden bij 77,8% van de getransplanteerde muizen (n = 7/9 dieren). Een voorbeeld van een gezichtstumor wordt geïllustreerd in aanvullende figuur 3. De methode die in dit p…

Discussion

Hersenmetastase is een complex proces van kankercellen die zich verspreiden van hun primaire plaats naar de hersenen. Er zijn verschillende diermodellen beschikbaar die bepaalde stadia van dit meerstappenproces weerspiegelen en er zijn fysiologische en praktische overwegingen voor het ontwerpen van preklinische metastasestudies^41,42. De meeste gepubliceerde studies die het gebruik van nanogeneeskunde voor de behandeling van hersenmetastase onderzoeken, hebben<sup…

Materials

100µm cell strainer	Corning	CLS431752
30G Microlance needle	BD	23748
31G Ultra-Fine II insulin syringe	BD	326103
Angled forceps	Proscitech	T67A-SS	Fine pointed, angled without serrations, 18mm tip, length 128 mm
Animal heat mat
Antibiotic and antimycotic	ThermoFisher Scientific	15240062
Autoclave bags
BT-474 (HTB-20) breast cancer cell line	ATCC	HTB-20
Buprenorphine (TEMGESIC)
Countess cell counter	ThermoFisher Scientific	C10227
Diet-76A	ClearH2O	72-07-5022
Dissection microscope
Ear puncher
Electric clippers
Fine angled forceps	Proscitech	DEF11063-07	Angled 45°, Tip smooth, Tip width: 0.4 mm, Tip dimension: 0.4 x 0.3 mm, length 9cm
Fine tubing for cannula, Tubing OD (in) 1/32, Tubing ID (in) 1/100in	Cole Parmer	EW-06419-00
Foetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	26140079
Hank's Balanced Salt Solution without calcium and magnesium	ThermoFisher Scientific	14170120
Hydrogel	ClearH2O	70-01-5022
Isoflurane
Kimwipes Low lint disposable wipers	Kimberly Clark- Kimwipes	Z188964
Mashed mouse chow
Meloxicam (METACAM)
Nose cone			Fashioned out of a microfuge tube
PAA ocular lubricant (Carbomer 2mg/g)	Bausch and lomb
Povidone-iodine solution	Betadine	2505692
PPE (glove, mask, gown, hairnet)
Retractors	Kent Scientific	SURGI-5001
RPMI 1640 Media	ThermoFisher Scientific	11875093
Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm	Ethicon	JJ-640G
Sterile normal saline	ThermoFisher Scientific	TM4469
Sticky tape
Surgical board			A chopping board wrapped with autoclavable bag.
Surgical scissors	Proscitech	T104	Tip Dimensions (LxD): 38x7mm, Length 115mm
Suture forcep/ Curved Brophy forceps	Proscitech	T113C	Curved, Rounded narrow 2 mm tip, with serrations, length 165 mm
Suture needle holder (Olsen Hegar needle holder)	Proscitech	TC1322-180	length 190 mm, ratchet clamp
Syringe driver with foot pedal/ UMP3 Ultra micro pump	World Precision Instruments	UMP3-3
T75 tissue culture flask	ThermoFisher Scientific	156499
Thread
Trigene II surface disinfectant	Ceva
Trypan Blue and Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
TrypLE Express dissociating medium	ThermoFisher Scientific	12605010