Aqui, descrevemos o isolamento de mitocôndrias de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo de camundongo e, em seguida, transferimos as mitocôndrias para oócitos de camundongos envelhecidos para melhorar a qualidade dos oócitos.
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Artigo de método
Aqui, descrevemos o isolamento de mitocôndrias de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo de camundongo e, em seguida, transferimos as mitocôndrias para oócitos de camundongos envelhecidos para melhorar a qualidade dos oócitos.
Devido ao declínio na quantidade e qualidade dos oócitos relacionados à idade, a fertilidade das mulheres com mais de 35 anos diminuiu drasticamente. Os mecanismos moleculares que mantêm a qualidade do oócito permanecem obscuros, portanto, é difícil aumentar a taxa de natalidade de mulheres com mais de 35 anos atualmente. Os oócitos contêm mais mitocôndrias do que qualquer tipo de célula do corpo, e qualquer disfunção mitocondrial pode levar à redução da qualidade do oócito. Na década de 1990, a transferência citoplasmática de oócitos resultou em grande sucesso na reprodução humana, mas foi acompanhada por controvérsias éticas. Espera-se que o transplante mitócondrio autólogo seja uma técnica útil para aumentar a qualidade dos oócitos que diminuíram devido à idade. No presente estudo, usamos células-tronco derivadas de tecido adiposo de camundongos idosos como doador de mitocôndrias para aumentar a qualidade dos oócitos de camundongos idosos. O desenvolvimento da tecnologia de transferência mitócondrial autóloga proporcionará um tratamento novo e eficaz para a infertilidade em mulheres idosas.
Um dos fatores importantes que afeta a fertilidade feminina é o envelhecimento do oócito; O declínio na qualidade do oócito é a principal causa de infertilidade em mulheres idosas. No entanto, a principal causa do envelhecimento oocitário e o mecanismo molecular que regula a qualidade do oócito ainda não estão claros. Estudos anteriores indicaram que tanto o número quanto a qualidade das mitocôndrias estão envolvidos no controle de qualidade dos oócitos e no desenvolvimento embrionário 1,2,3. A diminuição da quantidade e qualidade das mitocôn....
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Todos os experimentos em animais descritos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Terceiro Hospital Afiliado, Universidade de Soochow. Todas as operações seguem os cuidados e uso adequados dos animais e as diretrizes nacionais e de cuidados. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes de todos os materiais, instrumentos e reagentes usados neste protocolo.
1. Isolamento e caracterização de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo de camundongo envelhecido (ADSCs)
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Neste protocolo, isolamos e caracterizamos as ADSCs da gordura de camundongo (Figura 1). Para obter mitocôndrias isoladas, a membrana celular deve ser rompida usando um homogeneizador de vidro. (Figura 2A). É importante obter uma fração mitocondrial uniforme sem grandes aglomerados para que o tubo de microinjeção não seja bloqueado. Primeiro, 200 μL e depois 10 μL, ponteiras de pipeta devem ser usadas para ressuspender suavemente os homogeneizados; finalmente, u.......
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Os oócitos contêm mais mitocôndrias do que qualquer tipo de célula do corpo, com ~ 1-5 × 105 números de cópias de mtDNA. As mitocôndrias são essenciais para a maturação do oócito, fertilização e desenvolvimento embrionário, portanto, qualquer disfunção mitocondrial pode levar à diminuição da qualidade do oócito. A diminuição da quantidade e qualidade mitocondrial está intimamente relacionada ao envelhecimento fisiológico. Neste protocolo, um método simples para isolar mitocônd.......
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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Os autores desejam agradecer o apoio da Fundação Nacional de Ciências da Natureza da China (82001629 para XQS), do Projeto de Pesquisa Básica do Departamento de Ciência e Tecnologia de Changzhou sob o número de concessão CJ20200110 (para YJY), do Programa Juvenil da Fundação de Ciências Naturais da Província de Jiangsu (BK20200116 para XQS) e do Financiamento de Pesquisa de Pós-Doutorado da Província de Jiangsu (2021K277B para X, Q.S.).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,05% de tripsina/EDTA | Gibco | 25300054 | Cultura de Células |
| 4% de paraformaldeído | beyotime | P0099 | imunofluorescência |
| 40 μ filtro de células m | Corning | 352340 | ADSC isolamento |
| indução adipogênica | Cyagen | HUXXC-90031 | Diferenciação multidirecional |
| Solução de coloração vermelha de alizarina | Sigma | A5533 | Diferenciação multidirecional |
| Anticorpo contra CD29 | BD Biosciences | 558741 | análise de fluxo |
| Anticorpo contra CD34 | BD Biosciences | Análise de fluxo | 560942 |
| Anticorpo contra CD90 | BD Biosciences | Análise de | fluxo |
| Anticorpo contra HLA-DR | BD Biosciences | 555560 | Análise de fluxo |
| β-actina | Abcam ab-8226 | Teste de função mitocondrial | |
| BSA | Sigma | V900933 | imunofluorescência |
| CCCP | Solarbio | Análise | de fluxo de mitocôndrias C6700 JC-1 |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711 | qPCR |
| colagenase tipo I | Sigma | SCR103 | Isolamento ADSC |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | imunofluorescência |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | Cultura de células |
| DMSO | Sigma | 276855 | mitocôndrias JC-1 análise de fluxo |
| EGTA | Sigma | 324626 | Isolamento de mitocôndrias |
| FBS | Gibco | 10100147 | Cultura de células |
| Citometria de fluxo | BD Biosciences | FACSCanto& comércio; II | Características do microscópio de fluorescência ADSCs |
| leica | DM2500 | imunofluorescência | |
| Sigma | 48722 | diferenciação multidirecional | |
| Sangon | F519062 | Isolamento mitocondrial | |
| hCG | Aibei | M2520 | Superestimulação ovariana |
| hialuronidase | Sigma | H1115000 | Superestimulação ovariana |
| Microscópio invertido | Olympus | IMT-2 | |
| Kit de coloração de mitocôndrias isoladas | Sigma | CS0760 | análise de fluxo JC-1 |
| JC-1 | Sigma | T4069 | Teste de função mitocondrial |
| KCl | Sigma | P5405 | Transferência de mitocôndrias |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Transferência |
| de mitocôndriasLaminB | Abcam | ab-16048 Teste de | função mitocondrial |
| M16 Médio | Sigma | M7292 | cultura de células embrionárias |
| M2 Médio | Sigma | M7167 | manitol de cultura de células embrionárias |
| Sigma | M9546 | Microinjetor de transferência de mitocôndrias | |
| Olympus+ eppendorf | IX73 | Transferência de mitocôndrias | |
| MitoTracker vermelho | Invitrogen | M22425 | Coloração de mitocôndrias |
| MOPS | Sigma | M1442 | |
| Polipeptídeo mediador de neurofilamento | Santa Cruz Biotechnology | sc-16143 | diferenciação multidirecional |
| Gibco | A1647801 | Diferenciação multidirecional | |
| Enolase específica de neurônio (NSE) | Santa Cruz Biotechnology | sc-292097 | diferenciação multidirecional |
| Red O | Sangon | E607319 | Óleo de diferenciação adipogênica |
| solução vermelha O Sigma | O1516 | Diferenciação multidirecional | |
| osteogênica | Cyagen | HUXXC-90021 | Diferenciação multidirecional |
| PBS (solução salina tamponada com fosfato) | Hyclone | SH30256.LS | Cultura de células |
| penicilina e estreptomicina | Hyclone | SV30010 | Cell Culture |
| PMSG | Aibei | M2620 | |
| Coquetel inibidor de protease | Sigma | P8340 | Isolamento de mitocôndrias |
| sacarose | Sigma | V900116 | Isolamento de mitocôndrias |
| Tris | Sigma | 648314 | Isolamento de mitocôndrias |
| Tris-HCl | Sigma | 108319 | Transferência de mitocôndrias |
| Triton X-100 | beyotime | P0096 | imunofluorescência |
| VDAC | Abcam | ab-14734 Teste de | função mitocondrial |
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