Den nuværende protokol beskriver at lave et stort (6 x 3 mm2) kranievindue ved hjælp af madindpakning, gennemsigtig silikone og dækglas. Dette kraniale vindue tillader in vivo wide-field og to-foton calcium billeddannelse eksperimenter i samme mus.
Wide-field calcium billeddannelse fra musens neocortex gør det muligt at observere cortex-bred neural aktivitet relateret til forskellige hjernefunktioner. På den anden side kan to-fotonbilleddannelse løse aktiviteten af lokale neurale kredsløb på enkeltcelleniveau. Det er vigtigt at lave et stort kranievindue til at udføre analyse i flere skalaer ved hjælp af begge billeddannelsesteknikker i samme mus. For at opnå dette skal man fjerne en stor del af kraniet og dække den udsatte kortikale overflade med gennemsigtige materialer. Tidligere er glaskranier og polymerbaserede kranialvinduer blevet udviklet til dette formål, men disse materialer er ikke let fremstillet. Den nuværende protokol beskriver en enkel metode til fremstilling af et stort kranievindue bestående af kommercielt tilgængelig polyvinylidenchlorid (PVDC) indpakningsfilm, en gennemsigtig silikoneprop og et dækglas. Til billeddannelse af dorsaloverfladen på en hel halvkugle var vinduesstørrelsen ca. 6 x 3 mm2. Alvorlige hjernevibrationer blev ikke observeret uanset et så stort vindue. Det er vigtigt, at tilstanden af hjerneoverfladen ikke forværres i mere end en måned. Wide-field imaging af en mus, der udtrykker en genetisk kodet calciumindikator (GECI), GCaMP6f, specifikt i astrocytter, afslørede synkroniserede reaktioner i nogle få millimeter. To-fotonbilleddannelse af den samme mus viste fremtrædende calciumresponser i individuelle astrocytter over flere sekunder. Desuden blev et tyndt lag af en adeno-associeret virus påført PVDC-filmen og med succes udtrykt GECI i kortikale neuroner over kranialvinduet. Denne teknik er pålidelig og omkostningseffektiv til fremstilling af et stort kranialvindue og letter undersøgelsen af neurale og glialdynamikker og deres interaktioner under adfærd på makroskopiske og mikroskopiske niveauer.
Wide-field calcium imaging undersøger effektivt det spatiotemporale aktivitetsmønster over et stort område af dyrehjernen 1,2,3. Bredfeltsbilleddannelse er blevet brugt i vid udstrækning til at observere gnaveres hele kortikale overflade, da deres cortex er relativt flad 2,3,4,5,6,7,8,9,10. Transgene mus eller mus injiceret med adeno-associeret virus (AAV), som specifikt udtrykker GECI’er i forskellige celler såsom neuroner og gliaceller, kan bruges til bredfelt calciumbilleddannelse11,12,13. Imidlertid er den rumlige opløsning af denne teknik normalt ikke nok til at løse aktiviteten af individuelle celler in vivo14. Det er heller ikke egnet til billeddannelsesceller placeret i dybere lag.
På den anden side kan to-foton calciumbilleddannelse observere aktiviteten af flere celler samtidigt med subcellulær rumlig opløsning, hvilket tillader observation af aktiviteten af individuelle celler selv i neuronale dendritter og glialprocesser 15,16,17,18,19,20,21,22. Det kan også observere celler i dybere lag af hjernebarken23,24. Selvom de seneste teknologiske fremskridt inden for to-fotonmikroskopi muliggør billeddannelse fra millimeterbrede kortikale regioner 25,26,27,28,29, er det stadig vanskeligt at observere et område, der kan sammenlignes med bredfeltsbilleddannelse ved to-fotonbilleddannelse.
For at forstå den fysiologiske relevans af hjerneaktivitet fra enkeltcelle til hele hjernen er det afgørende at bygge bro mellem aktiviteten af kortikale regioner over hele cortex og den ved enkeltcelleopløsning i lokale neurale kredsløb. Derfor er en kombination af bredfelts- og to-fotoncalciumbilleddannelse udført i samme mus særlig effektiv. For at realisere dette skal der oprettes et bredt og stabilt kranievindue, ideelt set over en lang periode.
Tidligere er der udviklet flere teknikker til fremstilling af kraniale vinduer for at gøre det muligt at udføre bredfelts- og tofotonbilleddannelse i samme mus30,31. Trapezformede dækglasvinduer (krystalkraniet), der er støbt i form af den kortikale overflade for at erstatte den fjernede knogle, tillader optisk adgang over hele cortex32. Alternativt kan polymerbaserede kranialvinduer fremstilles med polyethylenterephthalat (PET)33 eller polyethylenoxidbelagte amorfe fluorpolymerer nanoark34. Hver metode har vist sig at opretholde et stabilt vindue i mere end 1 måned. Det er dog ikke let at producere disse vinduer, og de anvendte materialer og udstyr er ofte dyre.
Denne undersøgelse beskriver en ny metode til fremstilling af et stort kranievindue ved hjælp af PVDC-folien (plastfolie) (figur 1). Ved hjælp af dette vindue kan in vivo wide-field og to-foton billeddannelseseksperimenter udføres i de samme mus. Det har også vist sig, at GECI’er kunne udtrykkes i neuroner over et stort område af cortex hos mus ved at danne et tyndt lag film indeholdende AAV-partikler på wrap.
Denne artikel præsenterer en billig metode til at skabe et stort kranialvindue ved hjælp af en PVDC plastfolie, gennemsigtig silikone og dækglas. Ved hjælp af denne metode viste vi, at bredfelt calciumbilleddannelse kunne udføres over et stort område af hjernebarken. To-foton calcium billeddannelse kan udføres fra flere forskellige kortikale regioner i den samme mus, der har gennemgået bredfeltsbilleddannelse. Desuden har det vist sig, at en fibroin-AAV-film på plastfolien, der blev brugt til vinduet, kunne udtrykke GECI over et stort område af cortex.
Kritiske skridt
Det er vigtigt at undgå infektion og skade på hjernen, når man laver kraniale vinduer ved hjælp af plastfolie. Under disse forhold kan neural og glial aktivitet ikke observeres, og billeddannelse af dybere områder er umulig. Skade på blodkar resulterer også i blødning, hvilket gør billeddannelse umulig på grund af blod. For at undgå infektion er det afgørende at gøre hjerneoverfladen og indpakningen fastgjort så tæt som muligt ved at suge ACSF ud. Mannitol administration er vigtigt for at undgå hjerne- og blodkarskader ved at forhindre øget hjernetryk under operationen. Dette opretholder mellemrummet mellem hjernens overflade og dura mater og forhindrer hjernen og blodkarrene i at blive rørt under fjernelsen af kraniet og dura mater. Et stereomikroskop med høj forstørrelse og pincet med skarpe spidser er også effektive til nøjagtig kirurgi.
I fibroin-AAV-metoden er det vigtigt at anvende kødsilkeormskokoner, ikke at fryse fibroinopløsning, at tørre fibroin-AAV-opløsningen tilstrækkeligt og at anvende tilstrækkeligt volumen opløsning (5 μL pr. 3 mm diameter). Når ældre kokoner blev brugt, var udtrykseffektiviteten lavere. Dette skyldes, at fibroin fra gamle kokoner let kan denatureres. Når fibroinopløsningen blev frosset ned ved -80 °C og optøet på anvendelsestidspunktet, var ekspressionseffektiviteten dårlig. Dette kan skyldes denaturering af proteinet på grund af frysning og optøning. Da fibroinopløsninger, der opbevares ved 4 °C, kan anvendes effektivt indtil gelering, anbefales det, at fibroinopløsninger opbevares nedkølet og renses fra kokoner igen efter gelering. Fibroin-AAV-opløsningen skal tørres i mindst 3 timer, da ekspressionen er dårlig efter mindre end 3 timer. Endelig afhænger ekspressionsområdet af mængden af anvendt fibroin-AAV-opløsning. I eksemplet i figur 3M var mængden lille (5 μL); fibroin-AAV-filmen dækkede således kun den øverste halvdel af vinduet, hvilket resulterede i et ikke-ensartet udtryk over vinduet. Hvis der anvendes en tilstrækkelig mængde fibroin-AAV, vil udtrykket være ensartet over hele vinduet.
Modifikationer af teknikken
Den nye kraniale vinduesteknik gør det muligt at undersøge den makroskopiske aktivitet af kortikale kredsløb og deres underliggende enkeltcelleaktivitet i samme mus. Metoden kan således anvendes på en række neurovidenskabelige undersøgelser. For eksempel kan det bruges til at observere kortikal aktivitet under beslutningsopgaver, motorisk læring og i musemodeller af hjerneskade og sygdom. Vi mener også, at metoden ikke kun kan anvendes på gnavere, men også på ikke-menneskelige primater.
Dette papir viser, at det store kranialvindue er effektivt til billeddannelse af transgene mus og mus injiceret med AAV, der udtrykker funktionelle proteiner. Det er især vist, at fibroin-AAV-filmen på wrap er meget lettere end en konventionel AAV-injektionsmetode til at udtrykke GECI’er over cortexens brede område. Ved hjælp af en blanding af to AAV’er, der koder for GECI’er i forskellige farver41, kan korrelationen mellem neuron- og gliacelleaktivitet samtidig afbildes over et bredt område af cortex. Desuden kan fibroin-AAV-filmmetoden også anvendes på andre genetisk kodede biosensorer 42,43,44,45,46,47.
Det større kraniale vindue, som kan afbilde begge halvkugler, er også muligt. To-fotonmikroskoper med et meget bredere synsfelt (~ 25 mm2) er for nylig blevet udviklet 25,26,27,28,29. Ved at kombinere denne to-fotonbilleddannelsesteknik med en-foton bredfeltsbilleddannelse ved hjælp af det brede kraniale vindue, der er beskrevet her, vil vi kunne undersøge forholdet mellem befolkningsaktivitet og enkeltcelleaktivitet fra hidtil usete skalaer.
Begrænsninger
Madindpakningen tillader ingen stoffer at passere igennem. Dette gør metoden vanskelig at anvende til farmakologiske forsøg. Det er også vanskeligt at fjerne indpakningen, hvilket gør det umuligt at indsætte en glaspipette eller elektrode. Derfor er det svært at gennemføre eksperimenter kombineret med andre metoder såsom samtidig calciumbilleddannelse og elektrofysiologiske optagelser og lokal administration af lægemidler ved hjælp af en glaspipette. En mulig løsning på disse begrænsninger er at bruge wrap og glasvindue med et hul. Dette giver adgang til hjernen via en glaspipette eller en optageelektrode, samtidig med at kranievinduet holdes sterilt i lang tid48.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A) ‘Glial Decoding’ (JP21H05621 til SM), JSPS KAKENHI (JP19K06883 til SM, 15KK0340 til ES, JP22H00432, JP22H05160, JP17H06312 til HB og JP17H06313 til KK), Grant-in-Aid for Brain Mapping by Integrated Neurotechnologies for Disease Studies (Brain/MINDS) (JP19dm0207079h0002 til SM, JP19dm0207079 til HB og JP19dm0207080 til KK), Narishige Neuroscience Research Foundation (til SM), Tilskud til ung forsker fra Yamanashi Prefecture (til SM) og Takeda Science Foundation (til SM) og delvist støttet af The Frontier Brain Research Grant fra Univ. Yamanashi.
Vi takker N. Yaguchi og K. Okazaki for dyrepleje og teknisk bistand og medlemmer af Kitamura-laboratoriet for nyttige diskussioner.
4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan | TritonX | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
50 mL beaker | |||
Acquisition software | Brain vision | BV_Ana | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
Acquisition software | Hamamatsu photonics | High speed recording software: HSR | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Acquisition software | Vibrio Technologies | scanImage | For two-photon calcium imaging |
ACSF (artificial cerebrospinal fluid) | 150 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH = 7.4 with 1M NaOH | ||
ACSF aspiration needle | |||
Adeno-associated virus | VectorBuilder | custom-made | AAV-DJ/8-Syn1-XCaMP-R |
Adhesives for biological use | Daiichi Sankyo | Aron Alpha-A | |
Anesthesia machine | Shinano seisakusho | SN-487 | |
Anesthetic | Kyoritsu Seiyaku Corporation | pentobarbital | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Auxiliary ear bar | Narishige | EB-5N | |
CCD camera | Brain vision | MiCAM02-HR | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
Clear vinyl polysiloxane | GC | Exaclear | |
CMOS camera | Hamamatsu photonics | ORCA-spark | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Cotton swab | |||
Cover glass | Matsunami | 18 x 18 NO.1 | Size: 18 x 18 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm, Borosilicate glass |
DAPI | Thermo Fisher | D1306 | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Ddialysis cassette | 3.5K MWCO, Slide-A-Lyzer | ThermoFisher | |
Dental adhesive resin cement | SUN MEDICAL | Super-Bond | |
Dental drill | Nakanishi | VOLVERE Vmax | |
Digital scale | Dretec | KS-243 | |
Filters | Brain vision | EM: BP466/40-25, DM: DM506, EX: BP520/36-50 | |
Filters | Olympus | U-MRFPHQ, EM: BP535-555HQ, DM: DM565HQ, Ex: BA570-625HQ | |
Fluorescence microscope | Keyence | BZ-X810 | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Fluorescent beads | Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | 0.1 µm | Evaluation of the point spread function under the conventional and the new cranial windows in two-photon imaging |
Forceps | FST | No. 11252-20 | thin-tipped, for removal of dura mater |
Forceps | KFI | K-7, No.J 18-8 | for general use |
Gelatin for hemostasis | Johnson & Johnson | Spongostan | |
Gentamicin sulfate | Iwaki seiyaku | ||
Glass pipette | custom-made | ||
Hair remover | Reckitt Japan | Veet | |
Head fixing device | custom-made | Craniotomy for Cortical Voltage-sensitive Dye Imaging in Mice. Suzuki, T., and Murayama, M. Bio-protocol 2016 6:e1722. | |
Head plate | custom-made | aluminum or resin, size: 40 x 25 mm, thickness: 1.5 mm or 2 mm, hole in the center: 15 x 10 mm (head_plate_06 v3.f3d) | |
Heating pad | |||
Image processing software (for calcium imaging data analysis) | ImageJ | https://imagej.net | |
Isoflurane | Pfizer | ||
Light source | Hayashi-repic | LA-HDF108AA | |
Light source | Brain vision | LEX2-LZ4-B | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
Light source | Olympus | U-HGLGPS | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Mannitol solution (15% with saline) | Sigma-Aldrich (Merck) | M4125 | |
Micro curette | FST | No. 10080-05 | |
Microscope | Brain vision | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f | |
Microscope | Olympus | MVX10 | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Microscope | Sutter Instruments | MOM | For two-photon calcium imaging |
Microslicer | Dosaka EM | DTK-1000N | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Mixing tip | GC | ||
Needle (30 G) | |||
Polyethylens spoids | AS ONE | 1-4656-01 | |
Polyvinylidene chloride (PVDC) film | Asahi Kasei | Asahi Wrap (or Saran Wrap) | |
Povidone-iodine | Mundipharma | Isodine | |
Python libralies | NumPy | package for scientific computing, https://numpy.org/doc/stable/index.html# | |
Matplotlib | library for visualizations, https://matplotlib.org/stable/index.html# | ||
pandas | data analysis and manipulation tool, https://pandas.pydata.org | ||
Scalpel | Kai | No. 11 | |
Shaver for animal | |||
Silicone dispensers | GC | ||
Silkworm cocoon | Satoyama Craft News | https://sato-yama.jp/ | |
Stereomicroscope | LEICA | MZ6 | objective lens: 0.63x, eyepiece: 25x |
Surfactant | NACALAI TESQUE | TritonX | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Surgical Scissors | FST | No. 91460-11 | |
Syringe for mannitol injection | Terumo | 1mL | |
Transdermal anesthetic | AstraZeneca | Lidocaine | |
Transgenic mice used for calcium imaging of astrocytes | The mice were obtained by the following method. AldH1l1-CreERT2 mice: B6N.FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J (The Jackson laboratory, strain #: 031008) Tamoxifen-inducible Cre recombinase expression directed at high levels to the vast majority of astrocytes Flx-Lck-GCaMP6f mice: C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-GCaMP6f)Khak]/J (The Jackson laboratory, strain #: 029626) Cre-dependent expression of a plasma membrane-targeted GCaMP6f. A mouse born from crossbreeding these mice were treated with tamoxifen (20 mg/mL) for 5 days (0.05 mL/10g bw, i.p.) to express GCaMP6f. |
||
Tunable ultrafast lasers | Spectra-Physics | InSight X3 | For two-photon calcium imaging |
Waterproof film | Nichiban | BFR5 | |
Wild-type mice | Japan SLC | C57BL/6J | Male and femalek, >4 weeks old |