Den nåværende protokollen beskriver å lage et stort (6 x 3 mm2) kranialvindu ved hjelp av matfolie, gjennomsiktig silikon og dekkglass. Dette kraniale vinduet tillater in vivo vidfelt og to-foton kalsiumavbildningseksperimenter i samme mus.
Bredfelts kalsiumavbildning fra musens neocortex gjør det mulig å observere cortex-bred nevral aktivitet relatert til ulike hjernefunksjoner. På den annen side kan to-fotonavbildning løse aktiviteten til lokale nevrale kretser på enkeltcellenivå. Det er viktig å lage et stort kranialt vindu for å utføre flerskala analyse ved hjelp av begge bildebehandlingsteknikkene i samme mus. For å oppnå dette må man fjerne en stor del av skallen og dekke den eksponerte kortikale overflaten med gjennomsiktige materialer. Tidligere har glassskaller og polymerbaserte kranialvinduer blitt utviklet for dette formålet, men disse materialene er ikke lett produsert. Denne protokollen beskriver en enkel metode for å lage et stort kranialt vindu bestående av kommersielt tilgjengelig polyvinylidenklorid (PVDC) innpakningsfilm, en gjennomsiktig silikonplugg og et dekselglass. For avbildning av dorsaloverflaten på en hel halvkule var vindusstørrelsen ca. 6 x 3 mm2. Alvorlige hjernevibrasjoner ble ikke observert uavhengig av et så stort vindu. Det er viktig at tilstanden til hjerneoverflaten ikke forverres i mer enn en måned. Bredfeltsavbildning av en mus som uttrykker en genetisk kodet kalsiumindikator (GECI), GCaMP6f, spesielt i astrocytter, avslørte synkroniserte responser på noen få millimeter. To-fotonavbildning av samme mus viste fremtredende kalsiumresponser i individuelle astrocytter over flere sekunder. Videre ble et tynt lag av et adeno-assosiert virus påført PVDC-filmen og vellykket uttrykt GECI i kortikale nevroner over kranialvinduet. Denne teknikken er pålitelig og kostnadseffektiv for å lage et stort kranialt vindu og letter undersøkelsen av nevrale og glialdynamikk og deres interaksjoner under oppførsel på makroskopiske og mikroskopiske nivåer.
Bredfelts kalsiumavbildning undersøker effektivt det spatiotemporale aktivitetsmønsteret over et stort område av dyrehjernen 1,2,3. Bredfeltsavbildning har blitt mye brukt til å observere gnageres hele kortikale overflate siden deres cortex er relativt flat 2,3,4,5,6,7,8,9,10. Transgene mus eller mus injisert med adeno-assosiert virus (AAV), som spesifikt uttrykker GECI i forskjellige celler som nevroner og gliaceller, kan brukes til bredfelts kalsiumavbildning11,12,13. Imidlertid er den romlige oppløsningen av denne teknikken vanligvis ikke nok til å løse aktiviteten til individuelle celler in vivo14. Det er heller ikke egnet for avbildning av celler som ligger i dypere lag.
På den annen side kan to-foton kalsiumavbildning observere aktiviteten til flere celler samtidig med subcellulær romlig oppløsning, noe som tillater observasjon av aktiviteten til individuelle celler selv i nevronale dendritter og glialprosesser 15,16,17,18,19,20,21,22. Det kan også observere celler i dypere lag av hjernebarken23,24. Selv om nyere teknologiske fremskritt innen to-fotonmikroskopi muliggjør avbildning fra millimeterbrede kortikale regioner 25,26,27,28,29, er det fortsatt vanskelig å observere et område som kan sammenlignes med bredfeltsavbildning ved to-fotonavbildning.
For å forstå den fysiologiske relevansen av hjerneaktivitet fra enkeltcelle til helhjerne, er det viktig å bygge bro over gapet mellom aktiviteten til kortikale regioner over hele cortex og den ved enkeltcelleoppløsning i lokale nevrale kretser. Derfor er en kombinasjon av bredfelt og to-foton kalsiumavbildning utført i samme mus spesielt effektiv. For å realisere dette må det opprettes et bredt og stabilt kranialvindu, ideelt over en lang periode.
Tidligere har flere teknikker for å lage kraniale vinduer blitt utviklet for å tillate bredfelt og to-foton avbildning som skal utføres i samme mus30,31. Trapesformede dekselglassvinduer (krystallskalle), som er støpt i form av den kortikale overflaten for å erstatte det fjernede beinet, tillater optisk tilgang over hele cortex32. Alternativt kan polymerbaserte kranialvinduer fremstilles med polyetylentereftalat (PET)33 eller polyetylenoksidbelagte amorfe fluorpolymerer nanoark34. Hver metode har vist seg å opprettholde et stabilt vindu i mer enn 1 måned. Det er imidlertid ikke lett å produsere disse vinduene, og materialene og utstyret som brukes er ofte dyre.
Denne studien beskriver en ny metode for å lage et stort kranialt vindu ved hjelp av PVDC-filmen (plastfolie) (figur 1). Ved hjelp av dette vinduet kan in vivo vidfelt- og to-fotonavbildningseksperimenter utføres i samme mus. Det har også vist seg at GECI kan uttrykkes i nevroner over et bredt område av cortex av mus ved å danne et tynt lag av film som inneholder AAV-partikler på wrap.
Denne artikkelen presenterer en billig metode for å lage et stort kranialt vindu ved hjelp av en PVDC plastfolie, gjennomsiktig silikon og dekselglass. Ved hjelp av denne metoden viste vi at bredfelts kalsiumavbildning kunne utføres over et bredt område av hjernebarken. To-foton kalsiumavbildning kan utføres fra flere forskjellige kortikale regioner i samme mus som har gjennomgått vidfeltsavbildning. Videre har det vist seg at en fibroin-AAV-film på plastfolien som brukes til vinduet, kan uttrykke GECI over et bredt område av cortex.
Kritiske trinn
Det er viktig å unngå infeksjon og skade på hjernen når du lager kranialvinduer ved hjelp av plastfolie. Under disse forholdene kan nevral og glial aktivitet ikke observeres, og avbildning av dypere områder er umulig. Skader på blodkar resulterer også i blødning, noe som gjør bildebehandling umulig på grunn av blod. For å unngå infeksjon er det viktig å gjøre hjerneoverflaten og innpakningen festet så tett som mulig ved å suge ut ACSF. Mannitol administrasjon er viktig for å unngå hjerne- og blodkarskader ved å forhindre økt hjernetrykk under operasjonen. Dette opprettholder mellomrommet mellom overflaten av hjernen og dura mater og forhindrer at hjernen og blodkarene blir berørt under fjerning av skallen og dura mater. Et stereomikroskop med høy forstørrelse og pinsett med skarpe spisser er også effektivt for nøyaktig kirurgi.
I fibroin-AAV-metoden er det viktig å bruke kjøttsilkeormkokonger, ikke å fryse fibroinoppløsning, å tørke fibroin-AAV-løsningen tilstrekkelig, og å påføre nok volum oppløsning (5 μL per 3 mm diameter). Når eldre kokonger ble brukt, var uttrykkseffektiviteten lavere. Dette er fordi fibroin fra gamle kokonger lett kan denatureres. Når fibroinoppløsningen ble frosset ved -80 °C og tint på brukstidspunktet, var uttrykkseffektiviteten dårlig. Dette kan skyldes denaturering av proteinet på grunn av frysing og tining. Siden fibroinoppløsninger lagret ved 4 °C effektivt kan brukes til gelering, anbefales det at fibroinoppløsninger oppbevares i kjøleskap og renses fra kokonger igjen etter gelering. Fibroin-AAV-løsningen skal tørkes i minst 3 timer, da uttrykket er dårlig etter mindre enn 3 timer. Endelig avhenger uttrykksområdet av mengden fibroin-AAV-løsning som brukes. I eksemplet i figur 3M var mengden liten (5 μL); Dermed dekket fibroin-AAV-filmen bare den øvre halvdelen av vinduet, noe som resulterte i ujevnt uttrykk over vinduet. Hvis en tilstrekkelig mengde fibroin-AAV brukes, vil uttrykket være jevnt over hele vinduet.
Modifikasjoner av teknikken
Den nye kranialvinduteknikken gjør det mulig å undersøke den makroskopiske aktiviteten til kortikale kretser og deres underliggende enkeltcellenivåaktivitet i samme mus. Dermed kan metoden brukes på en rekke nevrovitenskapsstudier. For eksempel kan den brukes til å observere kortikal aktivitet under beslutningsoppgaver, motorisk læring og i musemodeller av hjerneskade og sykdom. Vi tror også at metoden ikke bare kan brukes på gnagere, men også på ikke-menneskelige primater.
Dette papiret viser at det store kranialvinduet er effektivt for avbildning av transgene mus og mus injisert med AAV som uttrykker funksjonelle proteiner. Spesielt er det vist at fibroin-AAV-filmen på omslaget er mye enklere enn en konvensjonell AAV-injeksjonsmetode for å uttrykke GECIer over det brede området av cortex. Ved hjelp av en blanding av to AAV-er som koder for GECIer i forskjellige farger41, kan korrelasjonen mellom nevron- og glialcelleaktivitet samtidig avbildes over et bredt område av cortex. Videre kan fibroin-AAV-filmmetoden også brukes på andre genetisk kodede biosensorer 42,43,44,45,46,47.
Det større kranialvinduet, som kan avbilde begge halvkule, er også mulig. To-foton mikroskoper med et mye bredere synsfelt (~ 25 mm2) har nylig blitt utviklet 25,26,27,28,29. Kombinere denne to-fotonavbildningsteknikken med en-foton vidvinkelavbildning ved hjelp av det brede kranialvinduet som er beskrevet her, vil tillate oss å undersøke forholdet mellom populasjonsaktivitet og enkeltcelleaktivitet fra enestående skalaer.
Begrensninger
Matinnpakningen tillater ikke noen stoffer å passere gjennom. Dette gjør metoden vanskelig å bruke til farmakologiske eksperimenter. Det er også vanskelig å fjerne innpakningen, noe som gjør det umulig å sette inn en glasspipette eller elektrode. Derfor er det vanskelig å gjennomføre eksperimenter kombinert med andre metoder som samtidig kalsiumavbildning og elektrofysiologiske opptak, og lokal administrering av legemidler ved hjelp av en glasspipette. En mulig løsning for disse begrensningene er å bruke innpaknings- og glassvinduet med et hull. Dette gir tilgang til hjernen via en glasspipette eller en opptakselektrode mens kranialvinduet holdes sterilt i lang tid48.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A) ‘Glial Decoding’ (JP21H05621 til SM), JSPS KAKENHI (JP19K06883 til SM, 15KK0340 til ES, JP22H00432, JP22H05160, JP17H06312 til HB, og JP17H06313 til KK), Grant-in-Aid for Brain Mapping by Integrated Neurotechnologies for Disease Studies (Brain / MINDS) (JP19dm0207079h0002 til SM, JP19dm0207079 til HB, og JP19dm0207080 til KK), Narishige Neuroscience Research Foundation (til SM), Grant for Young Researcher fra Yamanashi Prefecture (til SM), og Takeda Science Foundation (til SM) og delvis støttet av The Frontier Brain Research Grant fra Univ. Yamanashi.
Vi takker N. Yaguchi og K. Okazaki for dyrepleie og teknisk assistanse og medlemmer av Kitamura-laboratoriet for nyttige diskusjoner.
4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan | TritonX | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
50 mL beaker | |||
Acquisition software | Brain vision | BV_Ana | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
Acquisition software | Hamamatsu photonics | High speed recording software: HSR | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Acquisition software | Vibrio Technologies | scanImage | For two-photon calcium imaging |
ACSF (artificial cerebrospinal fluid) | 150 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH = 7.4 with 1M NaOH | ||
ACSF aspiration needle | |||
Adeno-associated virus | VectorBuilder | custom-made | AAV-DJ/8-Syn1-XCaMP-R |
Adhesives for biological use | Daiichi Sankyo | Aron Alpha-A | |
Anesthesia machine | Shinano seisakusho | SN-487 | |
Anesthetic | Kyoritsu Seiyaku Corporation | pentobarbital | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Auxiliary ear bar | Narishige | EB-5N | |
CCD camera | Brain vision | MiCAM02-HR | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
Clear vinyl polysiloxane | GC | Exaclear | |
CMOS camera | Hamamatsu photonics | ORCA-spark | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Cotton swab | |||
Cover glass | Matsunami | 18 x 18 NO.1 | Size: 18 x 18 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm, Borosilicate glass |
DAPI | Thermo Fisher | D1306 | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Ddialysis cassette | 3.5K MWCO, Slide-A-Lyzer | ThermoFisher | |
Dental adhesive resin cement | SUN MEDICAL | Super-Bond | |
Dental drill | Nakanishi | VOLVERE Vmax | |
Digital scale | Dretec | KS-243 | |
Filters | Brain vision | EM: BP466/40-25, DM: DM506, EX: BP520/36-50 | |
Filters | Olympus | U-MRFPHQ, EM: BP535-555HQ, DM: DM565HQ, Ex: BA570-625HQ | |
Fluorescence microscope | Keyence | BZ-X810 | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Fluorescent beads | Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | 0.1 µm | Evaluation of the point spread function under the conventional and the new cranial windows in two-photon imaging |
Forceps | FST | No. 11252-20 | thin-tipped, for removal of dura mater |
Forceps | KFI | K-7, No.J 18-8 | for general use |
Gelatin for hemostasis | Johnson & Johnson | Spongostan | |
Gentamicin sulfate | Iwaki seiyaku | ||
Glass pipette | custom-made | ||
Hair remover | Reckitt Japan | Veet | |
Head fixing device | custom-made | Craniotomy for Cortical Voltage-sensitive Dye Imaging in Mice. Suzuki, T., and Murayama, M. Bio-protocol 2016 6:e1722. | |
Head plate | custom-made | aluminum or resin, size: 40 x 25 mm, thickness: 1.5 mm or 2 mm, hole in the center: 15 x 10 mm (head_plate_06 v3.f3d) | |
Heating pad | |||
Image processing software (for calcium imaging data analysis) | ImageJ | https://imagej.net | |
Isoflurane | Pfizer | ||
Light source | Hayashi-repic | LA-HDF108AA | |
Light source | Brain vision | LEX2-LZ4-B | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
Light source | Olympus | U-HGLGPS | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Mannitol solution (15% with saline) | Sigma-Aldrich (Merck) | M4125 | |
Micro curette | FST | No. 10080-05 | |
Microscope | Brain vision | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f | |
Microscope | Olympus | MVX10 | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Microscope | Sutter Instruments | MOM | For two-photon calcium imaging |
Microslicer | Dosaka EM | DTK-1000N | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Mixing tip | GC | ||
Needle (30 G) | |||
Polyethylens spoids | AS ONE | 1-4656-01 | |
Polyvinylidene chloride (PVDC) film | Asahi Kasei | Asahi Wrap (or Saran Wrap) | |
Povidone-iodine | Mundipharma | Isodine | |
Python libralies | NumPy | package for scientific computing, https://numpy.org/doc/stable/index.html# | |
Matplotlib | library for visualizations, https://matplotlib.org/stable/index.html# | ||
pandas | data analysis and manipulation tool, https://pandas.pydata.org | ||
Scalpel | Kai | No. 11 | |
Shaver for animal | |||
Silicone dispensers | GC | ||
Silkworm cocoon | Satoyama Craft News | https://sato-yama.jp/ | |
Stereomicroscope | LEICA | MZ6 | objective lens: 0.63x, eyepiece: 25x |
Surfactant | NACALAI TESQUE | TritonX | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Surgical Scissors | FST | No. 91460-11 | |
Syringe for mannitol injection | Terumo | 1mL | |
Transdermal anesthetic | AstraZeneca | Lidocaine | |
Transgenic mice used for calcium imaging of astrocytes | The mice were obtained by the following method. AldH1l1-CreERT2 mice: B6N.FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J (The Jackson laboratory, strain #: 031008) Tamoxifen-inducible Cre recombinase expression directed at high levels to the vast majority of astrocytes Flx-Lck-GCaMP6f mice: C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-GCaMP6f)Khak]/J (The Jackson laboratory, strain #: 029626) Cre-dependent expression of a plasma membrane-targeted GCaMP6f. A mouse born from crossbreeding these mice were treated with tamoxifen (20 mg/mL) for 5 days (0.05 mL/10g bw, i.p.) to express GCaMP6f. |
||
Tunable ultrafast lasers | Spectra-Physics | InSight X3 | For two-photon calcium imaging |
Waterproof film | Nichiban | BFR5 | |
Wild-type mice | Japan SLC | C57BL/6J | Male and femalek, >4 weeks old |