Dette papiret presenterer protokoller for prosjektering og karakterisering av justerbare tredimensjonale sammensatte nettverk av sammenfiltrede aktinfilamenter og mikrotubuli. Kompositter gjennomgår aktiv restrukturering og ballistisk bevegelse, drevet av myosin II og kinesinmotorer, og er innstilt av de relative konsentrasjonene av aktin, mikrotubuli, motorproteiner og passive tverrbindinger.
Det sammensatte cytoskelettet, som består av interagerende nettverk av semifleksible aktinfilamenter og stive mikrotubuli, omstrukturerer og genererer krefter ved hjelp av motorproteiner som myosin II og kinesin for å drive viktige prosesser som migrasjon, cytokinese, adhesjon og mekanosensing. Mens aktin-mikrotubuli-interaksjoner er nøkkelen til cytoskelettets allsidighet og tilpasningsevne, er en forståelse av samspillet med myosin og kinesinaktivitet fortsatt begynnende. Dette arbeidet beskriver hvordan man konstruerer justerbare tredimensjonale sammensatte nettverk av sammenfiltrede aktinfilamenter og mikrotubuli som gjennomgår aktiv restrukturering og ballistisk bevegelse, drevet av myosin II- og kinesinmotorer, og er innstilt av de relative konsentrasjonene av aktin, mikrotubuli, motorproteiner og passive tverrbindinger. Protokoller for fluorescensmerking av mikrotubuli og aktinfilamenter for mest effektivt å visualisere kompositt restrukturering og bevegelse ved hjelp av multispektral konfokal avbildning er også detaljert. Til slutt presenteres resultatene av dataanalysemetoder som kan brukes til å kvantitativt karakterisere ikke-likevektsstruktur, dynamikk og mekanikk. Å gjenskape og undersøke denne justerbare biomimetiske plattformen gir verdifull innsikt i hvordan koblet motoraktivitet, komposittmekanikk og filamentdynamikk kan føre til utallige cellulære prosesser fra mitose til polarisering til mekano-sensasjon.
Cytoskelettet er et dynamisk sammensatt nettverk av samvirkende biopolymerer som gir strukturell og mekanisk støtte til celler. Assosierte molekylære motorer og bindende proteiner omstrukturerer og tilpasser cytoskelettet slik at cellene kan vokse, endre form, stivne, bevege seg og til og med helbrede seg selv, noe som muliggjør utallige cellulære prosesser som spenner fra migrasjon og deling til mekanosens 1,2. Utover sin betydning i cellulær biofysikk, er cytoskelettet også et typisk eksempel på aktiv materie med potensielle materialapplikasjoner som spenner fra sårheling og medikamentlevering til filtrering og myk robotikk 1,3,4,5,6,7,8,9.
De to nøkkelegenskapene som gir cytoskelettet sitt unike strukturelle og mekaniske mangfold og multifunksjonalitet er: 1) dets sammensatte natur, bestående av flere samvirkende proteinfilamenter, slik som semifleksible aktinfilamenter og stive mikrotubuli, samt deres tilknyttede bindings- og tverrbindingsproteiner 3,5,10; og 2) dens evne til kontinuerlig å omstrukturere, bevege seg, grov og utføre arbeid via energikrevende motorer, som myosiner og kinesiner, skyve og trekke på filamentøse proteiner 1,7,11,12,13. Selv om denne elegante kompleksiteten gjør det mulig for cytoskjelettet å formidle så forskjellige prosesser som cellemotilitet, cytokinese og sårheling 3,6,7,11, hemmer det forskernes evne til å reprodusere signaturen in vivo egenskaper av cytoskjelettet i rekonstituerte in vitro-systemer.
Nåværende grenserekonstitueringsarbeid fokuserer på kompositter av sammenfiltrede og tverrbundne aktinfilamenter og mikrotubuli 3,10,14,15,16,17, kraftgenererende aktomyosinnettverk 2,8,18,19,20,21, og aktiv nematikk drevet av kinesin-mikrotubuli interaksjoner 22,23,24,25,26. Steady-state aktin-mikrotubulikompositter har vist seg å vise fremvoksende mekaniske egenskaper15,16,27, for eksempel forbedret filamentmobilitet og økt stivhet sammenlignet med enkeltkomponentsystemer 27. Studier på in vitro aktomyosinsystemer har rapportert et bredt spekter av strukturelle og dynamiske egenskaper som avhenger av konsentrasjonene av aktin, myosin og tverrbindinger 28,29,30,31. For eksempel, med tilstrekkelig tverrbinding, gjennomgår aktomyosinnettverk storskala sammentrekning og grovhet 2,28,30,32,33,34,35,36, mens uten tverrbindinger viser nettverk rask, destabiliserende strømning og brudd 19,29 . Rekonstituert mikrotubulibasert aktiv nematikk som bruker klynger av kinesinmotorer til å krysslenke og trekke på mikrotubulibunter, har blitt rapportert å vise langvarige turbulente strømmer, forlengelse, knekking, oppsprekking og helbredelse 12,22,23,24,25,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47.
Mer nylig har aktin-mikrotubulikompositter drevet av myosin II minifilamenter vist seg å føre til mer bestilt sammentrekning og nettverksintegritet sammenlignet med den uordnede strømmen og nettverksbruddet som aktomyosinnettverk uten tverrbindinger viser 17,26,48. Videre optimaliseres kombinasjonen av komposittrobusthet og kraftgenerering når aktin og mikrotubuli er tilstede ved sammenlignbare konsentrasjoner. Viktige fremvoksende funksjoner i denne regionen av formuleringsrommet inkluderer forbedret mekanisk styrke 26, koordinert bevegelse av aktin og mikrotubuli26, jevn vedvarende sammentrekning og mesoskala restrukturering17.
Her beskrives protokoller for å konstruere og justere sammenfiltrede og tverrbundne kompositter av mikrotubuli og aktinfilamenter som skyves ut av likevekt av myosin II minifilamenter og kinesinklynger som virker på henholdsvis aktinfilamenter og mikrotubuli (figur 1). Dynamikken, strukturen og mekanikken til denne klassen av kompositter kan justeres av de relative konsentrasjonene av filamenter, motorer og tverrbindinger for å vise et rikt faserom med advektiv og turbulent strømning, isotropisk sammentrekning, akselerasjon, retardasjon, de-blanding, stivning, avslapning og brudd. Fokuset i dette arbeidet er å forberede og justere denne klassen av aktive cytoskeletale kompositter. Men for å hjelpe forskere med benchmarking og karakterisering av de beskrevne aktive komposittene, er effektive bildebehandlingsmetoder ved bruk av multispektral konfokalmikroskopi også detaljert. Til slutt presenteres resultater av viktige beregningsanalysemetoder som kan brukes til å måle dynamikken, strukturen og mekanikken til komposittene. Forskere oppfordres til å ta i bruk disse metodene – som inkluderer differensiell dynamisk mikroskopi (DDM), romlig bildeautokorrelasjon (SIA) og partikkelbildevelocimetry (PIV) – da de er optimalisert for å karakterisere den komplekse dynamikken og strukturelle mangfoldet av komposittene 17,26,49.
Trinnene beskrevet nedenfor fokuserer på å forberede komposittene og avbilde dem ved hjelp av konfokalmikroskopi. Protokoller som beskriver dataanalyse etter innsamling og optiske pinsettmålinger finnes i tidligere arbeider 17,26,48,50, og leveres på forespørsel. Alle materialer er oppført i tabellen over materialer som følger med.
Et viktig fremskritt for det rekonstituerte systemet beskrevet ovenfor er dets modularitet og tunabilitet, slik at brukerne oppfordres til å endre konsentrasjonene av proteiner, motorer, tverrbindinger, etc. for å passe til de ønskede resultatene, enten det er å etterligne en bestemt cellulær prosess eller konstruere et materiale med spesifikk funksjonalitet eller mekaniske egenskaper. Begrensninger på konsentrasjonsområdet for aktin og tubulin er satt til nedre grense av den kritiske konsentrasjonen som trengs for å polymerisere aktin (~ 0,2 μM) 57,58,59 og tubulin (~ 3 – 4 μM) 60, og ved øvre grense ved overgang til nematisk justering av aktinfilamenter (~ 90 μM) 61,62 eller mikrotubuli (~ 35 μM) 63 . Aktinmonomerer og tubulindimerer bør polymeriseres til filamenter sammen, i stedet for å blandes sammen etter polymerisering, for å sikre at de danner homogent interpenetrerende perkolerte nettverk som synergistisk støtter hverandre. Den nye dynamikken som komposittene viser, er avhengig av dette samspillet. Selv om det generelt er viktig å følge alle trinnene som beskrevet i protokollen for å kunne reprodusere resultatene som vises, er noen trinn mer krevende, mens andre har plass til å endre og justere for å passe til spesifikke behov og tilgjengelige ressurser.
For eksempel er et viktig skritt for å sikre reproduserbare resultater riktig forberedelse og lagring av reagensene i henhold til retningslinjene gitt i materialtabellen. Cytoskeletale proteiner (aktin, tubulin, myosin, kinesin) er labile og skal aliquoteres, flashfryses med flytende nitrogen og lagres ved -80 °C i engangsaliquoter. Når aliquotene er fjernet fra -80 °C, skal de oppbevares på is. Cytoskeletale proteiner beholder ikke pålitelig funksjon etter ytterligere fryse-tine sykluser.
Mikrotubuli er mer følsomme for depolymerisering og denaturering enn aktin. Når tubulin er fjernet fra -80 °C, bør den oppbevares på is før polymerisasjon og brukes innen 12 timer. Når polymerisert, bør mikrotubuli holdes ved romtemperatur. Det er også viktig å stabilisere mikrotubuli med taxol for å forhindre depolymerisering. Phalloidin-stabilisering av aktinfilamenter er også viktig for å undertrykke ATP-konsumerende aktin-tredemølle som konkurrerer med myosin- og kinesinaktivitet.
Ultracentrifugation av myosin motorer er et annet kritisk skritt, da det fjerner inaktive myosin døde hoder. Fjerning av enzymatisk inaktive monomerer resulterer i passiv kryssbinding av aktinnettverket og tap av aktivitet. For å forlenge ATPase-aktiviteten til motorer, kan et ATP-regenereringssystem som kreatinfosfat og kreatinfosfokinase64 inkorporeres.
Til slutt krever opprettholdelse av komposittaktivitet inhibering av adsorpsjon av filamenter og motorer til prøvekammerets vegger, noe som kan oppnås ved passivering av mikroskopdekslene og lysbildene. Motorproteiner er spesielt utsatt for adsorpsjon, noe som resulterer i at kompositten blir trukket til overflaten av prøvekammeret, beveger seg ut av synsfeltet, kollapser til 2D og ikke lenger gjennomgår aktivitet. Silanisering av deksler og lysbilder er en effektiv måte å passivere overflatene og forhindre adsorpsjon (se trinn 1). En alternativ passiveringsmetode som brukes effektivt i in vitro cytoskeletteksperimenter, er å belegge overflaten med et lipid-dobbeltlag, lik cellemembranen18. Denne metoden er fordelaktig hvis man ønsker å binde proteiner til overflaten eller introdusere andre spesifikke protein-overflate-interaksjoner, fordi dobbeltlaget kan funksjonaliseres. For optiske pinsetteksperimenter er passivering av mikrosfærene også kritisk, og kan oppnås ved å belegge karboksylerte mikrosfærer med BSA eller PEG via karbodimidtverrbindingskjemi48.
Det er noen aspekter av de presenterte protokollene som forskere kan vurdere å endre for å passe deres behov. For det første kan forskere velge å erstatte ikke-innfødte biotin-NA-tverrbindinger med biologiske tverrbindinger, for eksempel alfa-aktinin eller MAP65 som tverrbinder aktin og mikrotubuli, henholdsvis 28,65,66. Bruken av ikke-innfødte tverrbindinger i komposittene som er beskrevet her, er motivert av deres forbedrede reproduserbarhet, stabilitet og tunbarhet sammenlignet med innfødte tverrbindinger. På grunn av den sterke biotin-NA-bindingen kan tverrbindinger antas å være permanente, i stedet for de fleste innfødte tverrbindinger som forbigående binder seg til omfattende omsetningshastigheter. Dynamikken i forbigående tverrbinding kompliserer analysen av bidragene fra tverrbindinger og motorer til dynamikken. Videre kan biotin-NA-linkere allsidig brukes til å kryssbinde både aktin og mikrotubuli, samt tverrbindingsaktin til mikrotubuli. På denne måten kan en entydig sammenligning mellom tverrbindingsmotiver gjøres, slik at alle andre variabler (f.eks. Kryssbindingsstørrelse, bindingsaffinitet, støkiometri, etc.) er faste. Endelig er reagensene som trengs for å innlemme biotin-NA-linkere, allment tilgjengelige, godt karakteriserte og ofte brukt i mange biofysikklaboratorier. En av de viktigste styrkene til in vitro-plattformen som er beskrevet her, er imidlertid dens modularitet, så forskere bør kunne sømløst erstatte biotin-NA-linkere med innfødte linkere hvis de velger.
For det andre, i den nåværende protokollen, polymeriseres aktinmonomerer og tubulindimerer til filamenter sammen i et sentrifugerrør før de tilsettes prøvekammeret. Strømning av løsningen av sammenfiltrede filamentøse proteiner inn i prøvekammeret kan forårsake strømningsjustering, spesielt av mikrotubuli, som bryter ønsket isotropi og homogenitet av komposittene. Faktisk var et stort fremskritt i tidligere arbeid med steady-state actin-mikrotubulikompositter evnen til å kopolymerisere aktin og mikrotubuli in situ (i prøvekammeret) for å sikre dannelse av isotrope interpenetrerende nettverk av aktin og mikrotubuli15,16,27. Å utvide denne tilnærmingen til aktive kompositter vil imidlertid kreve å legge motorene til prøven før aktin- og tubulinpolymerisering og få hele prøven til å inkubere sammen ved 37 ° C før eksperimenter. Tester av denne variasjonen til protokollen har resultert i redusert aktinpolymerisasjon og ingen merkbar motoraktivitet, sannsynligvis på grunn av konkurrerende ATPase-aktivitet og den langvarige 37 °C-inkubasjonen av motorene. Heldigvis er det ingen merkbar flytjustering av kompositter når man følger gjeldende protokoller, som det fremgår av figur 2, figur 3 og figur 6. Likevel oppfordres forskere til å designe protokoller som tillater in situ dannelse av aktive kompositter.
Et annet poeng å vurdere er fluorescensmerkingsordningen, som innebærer sparsomt merking av alle aktinfilamenter og mikrotubuli i nettverket. Denne merkingsmetoden ble optimalisert for å direkte visualisere strukturen i nettverket i stedet for å utlede struktur og dynamikk via sporfilamenter eller mikrosfærer. Avveiningen er imidlertid at individuelle filamenter ikke er sterkt merket og løsbare. En tilnærming som forskere kan ta for å både løse enkeltfilamenter og visualisere nettverksstruktur, er å dope i forhåndsformede filamenter merket med en annen fluorofor, slik at både det omkringliggende nettverket og individuelle filamenter kan avbildes samtidig. Men når du bruker mer enn to fluoroforer og eksitasjons- / utslippskanaler, er blødning mellom kanaler ofte vanskelig å eliminere, så det må utvises forsiktighet ved valg av fluoroforer, filtre og laserintensiteter.
En relatert begrensning er manglende evne til å visualisere myosin- eller kinesinmotorene i komposittene. De fluorescerende merkede aktinmonomerer og tubulindimerer som brukes er kommersielt tilgjengelige, mens visualisering av myosin eller kinesin i kompositter krever intern merking. Forskere oppfordres til å ta neste skritt for å merke motorer, som gjort tidligere18,67, for å kunne utvetydig knytte motoraktivitet og binding til dynamikken og strukturene som våre kompositter viser.
Til slutt er det viktig å merke seg at i gjeldende protokoll er utbruddet og varigheten av kinesinaktiviteten ikke kontrollert. Fordi myosinaktiviteten styres ved hjelp av fotodeaktivering av blebbistatin, som beskrevet ovenfor, for å bygge inn lignende lysaktivering av kinesin, kan man innlemme lysaktivert ATP.
For å bygge opp kompleksiteten i designene som er beskrevet her, for bedre å etterligne cellulære forhold og utvide parameterrommet for dynamisk struktur-funksjon, vil fremtidig arbeid fokusere på å inkorporere mellomliggende filamenter, for eksempel vimentin68,69, samt andre motorer som dynein13,70. Gelsolin vil også bli innlemmet i forskjellige konsentrasjoner for å kontrollere aktinlengde14, samt tau-protein for å kontrollere mikrotubulistivhet.
Oppsummert beskriver de presenterte protokollene hvordan man designer, skaper og karakteriserer dynamikken, strukturen og mekanikken til cytoskelettinspirerte aktive materiesystemer, som inneholder to separate aktive kraftgenererende komponenter som virker på forskjellige substrater i et enkelt system. Denne justerbare og modulære plattformen bringer rekonstitueringsarbeidet et viktig skritt nærmere å etterligne det cellulære cytoskelettet og tilbyr den unike muligheten til å programmere egenskapene over et bredt faserom ved uavhengig å innlemme, fjerne og justere de forskjellige komponentene. Videre er alle komponenter i dette allsidige systemet kommersielt tilgjengelige (se materialtabell), bortsett fra kinesindimerene som er renset i Ross Lab, som beskrevet tidligere50, og tilgjengelig på forespørsel. Endelig er all analysekode fritt tilgjengelig gjennom GitHub49 og er basert på gratis programmeringsspråk og programvare (Python og Fiji). Den gjennomsiktige formidlingen av protokoller for å designe disse systemene vil forhåpentligvis gjøre denne plattformen mer tilgjengelig for en mangfoldig gruppe brukere med ulik kompetanse, bakgrunn, institusjonell tilknytning og forskningsmål.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner Maya Hendija og Dr. Jonathan Michel for hjelp med dataanalyse, og Dr. Janet Sheung, Dr. Moumita Das og Dr. Michael Rust for nyttige diskusjoner og veiledning. Denne forskningen ble støttet av et William M. Keck Foundation Research Grant og NSF DMREF Award (DMR 2119663) tildelt RMRA og JLR og National Institutes of Health R15 Grants (R15GM123420, 2R15GM123420-02) tildelt RMR-A og RJM.
(-)-Blebbistatin Abbreviation used in paper: blebbistatin |
Sigma Aldrich | B0560 | Stock Concentration: 200 μM in DMSO Storage: dessicated, in DMSO, -20ºC Stock and Experiment Recipes: dissolve 1 mg of powder to 200 μM in DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: limited shelf-life, typically stops functioning reliably after 3-4 months. purchase and prepare new solution every 3 months. |
1:20 488-tubulin:tubulin mixture Abbreviation used in paper: 5-488-tubulin |
NA | NA | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: mix tubulin and 488-tubulin at a 20:1 ratio, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light |
1:20 R-tubulin:tubulin mixture Abbreviation used in paper: 5-R-tubulin |
NA | NA | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: mix tubulin and rhodamine tubulin at a 20:1 ratio, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light |
actin (biotin): skeletal muscle Abbreviation used in paper: biotin-actin |
Cytoskeleton | AB07 | Stock Concentration: 1 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: (1) immediately prior to use dilute to 0.5 mg/ml in PEM, (2) once removed from -80ºC, store aliquot on ice at 4ºC for up to 1 week |
actin (rhodamine): rabbit skeletal muscle Abbreviation used in paper: R-actin |
Cytoskeleton | AR05 | Stock Concentration: 1.5 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1.5 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: once removed from -80ºC, store aliquot on ice at 4ºC, can be used for up to 1 week |
adenosine triphosphate Abbreviation used in paper: ATP |
Thermo Fisher Scientific | A1048 | Stock Concentration: 100 mM Storage: in solution (pH 7), -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconsitute in DI H20, bring pH to 7 with NaOH Storage, Handling, Troubleshooting Notes: routinely check pH and adjust as needed, hydrolyzes over time, replace every ~6-12 months |
AlexaFluor488 Phalloidin Abbreviation used in paper: 488-phalloidin |
Thermo Fisher Scientific | A12379 | Stock Concentration: 100 μM DMSO Storage: protected from light, dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 100 μM with DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 20 μM in PEM (1 μL in 4 μL PEM) |
AlexaFluor488–labeled actin Abbreviation used in paper: 488-actin |
Thermo Fisher Scientific | A12373 | Stock Concentration: 1.5 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1.5 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: this item has been discontinued |
Basic Plasma Cleaner Abbreviation used in paper: plasma cleaner |
Harrick Plasma | PDC-32G | |
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film Abbreviation used in paper: transparent film |
Thermo Fisher Scientific | 13-374-5 | |
D-(+)-Glucose Abbreviation used in paper: |
Thermo Fisher Scientific | A1682836 | Stock Concentration: 100x Storage: store at stock concentration (100x) or 10x concentration, dessicated, at -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 4.5 mg/ml in DI H20 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: final concentration in solution should 45 μg/mL |
D-Biotin Abbreviation used in paper: biotin |
Fisher Scientific | BP232-1 | Stock Concentration: 1.02 mM in PEM Storage: dessicated, 4ºC |
deionized nanopure water Abbreviation used in paper: DI |
|||
Dimethyldichlorosilane Abbreviation used in paper: silane |
Thermo Fisher Scientific | D/3820/PB05 | Stock Concentration: 2% dissolved in Toulene |
Dithiothreitol Abbreviation used in paper: DTT |
Thermo Fisher Scientific | R0861 | Stock Concentration: 1 M in DMSO Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: dilute to 2 mM in PEM immediately before each experiment |
DMSO Anhydrous Abbreviation used in paper: DMSO |
Thermo Fisher Scientific | D12345 | |
F-Buffer Abbreviation used in paper: F-buffer |
NA | NA | Stock Concentration: 10x Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: 10 mM Imidazole (pH 7.0), 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0.2 mM ATP |
G-Buffer Abbreviation used in paper: G-buffer |
NA | NA | Stock Concentration: 10x Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: 2.0 mM Tris (pH 8), 0.2 mM ATP, 0.5 mM DTT, 0.1 mM CaCl2. Store at -20°C. |
glass microscope slide Abbreviation used in paper: slide |
Thermo Fisher Scientific | 22-310397 | |
Glucose oxidase + catalase + β-mercaptoethanol Abbreviation used in paper: GOC |
Sigma Aldrich | G2133-250KU, C1345, 63689 | Stock Concentration: 100x Storage: store at stock concentration (100x) or 10x concentration, dessicated, at -20ºC Stock and Experiment Recipes: For 100x: 4.3 mg/ml glucose oxidase, 0.7 mg/ml catalase, 0.5% v/v β-mercaptoethanol in DI H20 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: final concentration in solution should be: 0.005% β-mercaptoethanol, 43 μg/mL glucose oxidase, 7 μg/mL catalase |
glu-GOC oxygen scavenging system Abbreviation used in paper: glu-GOC |
NA | NA | Stock Concentration: 100x Storage: prepare fresh each time Stock and Experiment Recipes: mix equal parts Glu and GOC and add at 1/100 final sample volume immediately before imaging Storage, Handling, Troubleshooting Notes: prepare from Glu and GOC immediately before imaging |
Guanosine triphosphate Abbreviation used in paper: GTP |
Thermo Fisher Scientific | R0461 | Stock Concentration: 100 mM Storage: 100 μL aliquots at -20ºC |
Instant Mix 1-minute epoxy Abbreviation used in paper: epoxy |
Loctite | 1366072 | |
Kinesin-1 401 BIO 6x HIS Abbreviation used in paper: kinesin |
Prepared in JL Ross Lab at Syracuse University | NA | Stock Concentration: 8.87 μM in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Storage, Handling, Troubleshooting Notes: biotinylated dimers form kinesin clusters, each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC |
NeutrAvidin Abbreviation used in paper: NA |
Thermo Fisher Scientific | 31000 | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM |
No 1. glass coverslips (24 mm x 24 mm) Abbreviation used in paper: coverslip |
Thermo Fisher Scientific | 12-548-CP | |
Paclitaxel Abbreviation used in paper: Taxol |
Thermo Fisher Scientific | P3456 | Stock Concentration: 2 mM in DMSO Storage: protected from light, dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 2 mM with DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 200 μM in DMSO (0.4 μL in 3.6 μL DMSO) |
PEM-100 Abbreviation used in paper: PEM |
NA | NA | Stock Concentration: 1x Storage: room temperature (RT) Stock and Experiment Recipes: 100 mM K-PIPES (pH 6.8), 2 mM EGTA, 2 mM MgCl2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: use KOH to adjust pH to 6.8, recheck pH often and adjust accordingly |
phalloidin Abbreviation used in paper: phalloidin |
Thermo Fisher Scientific | P3457 | Stock Concentration: 100 μM in DMSO Storage: protected from light, dessicated, -20ºC, adhere closely to storage/handling conditions Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 100 μM with DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: susceptible to impurities in its preparation and denaturing, identifiable as large amorphous aggregates of actin in samples |
porcine brain tubulin Abbreviation used in paper: tubulin |
Cytoskeleton | T240 | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC |
Potassium Chloride Abbreviation used in paper: KCl |
Thermo Fisher Scientific | AM9640G | Stock Concentration: 4 M Storage: RT |
Rabbit skeletal actin Abbreviation used in paper: actin |
Cytoskeleton | AKL99 | Stock Concentration: 2 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 2 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: once removed from -80ºC, store aliquot on ice at 4ºC, can be used for up to 1 week |
Rabbit skeletal myosin II Abbreviation used in paper: myosin |
Cytoskeleton | MY02 | Stock Concentration: 10 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 10 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: monomers form minifilaments at low KCl, each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC |
Tubulin (biotin): porcine brain Abbreviation used in paper: biotin-tubulin |
Cytoskeleton | T333P | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 0.5 mg/ml in PEM |
Tubulin (fluorescent HiLyte 488): porcine brain Abbreviation used in paper: 488-tubulin |
Cytoskeleton | TL488M | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light |
tubulin (rhodamine): porcine brain Abbreviation used in paper: R-tubulin |
Cytoskeleton | TL590M | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light |
Tween 20 Abbreviation used in paper: Tween20 |
Thermo Fisher Scientific | J20605.AP | Stock Concentration: 1% v/v in DI H20 Storage: RT |
ultracentrifuge grade microtubes Abbreviation used in paper: Beckman-Coulter Optima Max XP |
Beckman Coultier | 343776 | Storage, Handling, Troubleshooting Notes: 8×34 mm PC |
UV light curing glue Abbreviation used in paper: UV glue |
Pharda | SKG-2869 |