Detta dokument presenterar protokoll för konstruktion och karakterisering av avstämbara tredimensionella kompositnätverk av samintrasslade aktinfilament och mikrotubuli. Kompositer genomgår aktiv omstrukturering och ballistisk rörelse, driven av myosin II- och kinesinmotorer, och stäms av de relativa koncentrationerna av aktin, mikrotubuli, motorproteiner och passiva tvärbindare.
Den sammansatta cytoskeletten, som består av interagerande nätverk av semiflexibla aktinfilament och styva mikrotubuli, omstrukturerar och genererar krafter med hjälp av motorproteiner såsom myosin II och kinesin för att driva viktiga processer såsom migration, cytokinese, vidhäftning och mekanosensering. Medan aktin-mikrotubuliinteraktioner är nyckeln till cytoskelettens mångsidighet och anpassningsförmåga, är en förståelse för deras samspel med myosin- och kinesinaktivitet fortfarande framväxande. Detta arbete beskriver hur man konstruerar avstämbara tredimensionella kompositnätverk av samintrasslade aktinfilament och mikrotubuli som genomgår aktiv omstrukturering och ballistisk rörelse, driven av myosin II och kinesinmotorer, och är inställda av de relativa koncentrationerna av aktin, mikrotubuli, motorproteiner och passiva tvärbindare. Protokoll för fluorescensmärkning av mikrotubuli och aktinfilament för att mest effektivt visualisera sammansatt omstrukturering och rörelse med hjälp av multispektral konfokal avbildning är också detaljerade. Slutligen presenteras resultaten av dataanalysmetoder som kan användas för att kvantitativt karakterisera icke-jämviktsstruktur, dynamik och mekanik. Att återskapa och undersöka denna avstämbara biomimetiska plattform ger värdefull insikt i hur kopplad motorisk aktivitet, kompositmekanik och filamentdynamik kan leda till otaliga cellulära processer från mitos till polarisering till mekano-sensation.
Cytoskeletten är ett dynamiskt kompositnätverk av interagerande biopolymerer som ger strukturellt och mekaniskt stöd till celler. Associerade molekylära motorer och bindande proteiner omstrukturerar och anpassar cytoskeletten för att tillåta celler att växa, ändra form, stelna, röra sig och till och med självläka, vilket möjliggör otaliga cellulära processer som sträcker sig från migration och delning till mekanosens 1,2. Utöver dess betydelse i cellulär biofysik är cytoskelettet också ett typiskt exempel på aktiv materia med potentiella materialapplikationer som sträcker sig från sårläkning och läkemedelsleverans till filtrering och mjuk robotik 1,3,4,5,6,7,8,9.
De två viktigaste egenskaperna som ger cytoskeletten dess unika strukturella och mekaniska mångfald och multifunktionalitet är: 1) dess sammansatta natur, bestående av flera interagerande proteinfilament, såsom halvflexibla aktinfilament och styva mikrotubuli, samt deras associerade bindande och tvärbindande proteiner 3,5,10; och 2) dess förmåga att kontinuerligt omstrukturera, flytta, grova och utföra arbete via energiförbrukande motorer, såsom myosiner och kinesiner, trycka och dra på de trådformiga proteinerna 1,7,11,12,13. Även om denna eleganta komplexitet gör det möjligt för cytoskeletten att förmedla processer så olika som cellmotilitet, cytokinese och sårläkning 3,6,7,11, hämmar det forskarnas förmåga att reproducera cytoskelettens signatur in vivo-egenskaper i rekonstituerade in vitro-system.
Nuvarande gränsrekonstitueringsinsatser fokuserar på kompositer av intrasslade och tvärbundna aktinfilament och mikrotubuli 3,10,14,15,16,17, kraftgenererande aktomyosinnätverk2,8,18,19,20,21 och aktiv nematik driven av kinesin-mikrotubuli interaktioner22,23,24,25,26. Steady-state aktin-mikrotubulikompositer har visat sig uppvisa emergenta mekaniska egenskaper15,16,27, såsom förbättrad filamentrörlighet och ökad styvhet jämfört med enkomponentsystem 27. Studier på in vitro-aktomyosinsystem har rapporterat ett brett spektrum av strukturella och dynamiska egenskaper som beror på koncentrationerna av aktin, myosin och tvärbindare28,29,30,31. Till exempel, med tillräcklig tvärbindning, genomgår aktomyosinnätverk storskalig sammandragning och grov 2,28,30,32,33,34,35,36, medan utan tvärbindare visar nätverk snabbt, destabiliserande flöde och brott 19,29 . Rekonstituerade mikrotubulibaserade aktiva nematik som använder kluster av kinesinmotorer för att tvärbinda och dra i mikrotubulibuntar har rapporterats uppvisa långvariga turbulenta flöden, förlängning, buckling, sprickbildning och läkning 12,22,23,24,25,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47.
På senare tid har aktin-mikrotubulikompositer drivna av myosin II-minifilament visat sig leda till mer ordnad sammandragning och nätverksintegritet jämfört med det oordnade flödet och nätverksbrottet som aktomyosinnätverk utan tvärbindare uppvisar 17,26,48. Dessutom optimeras kombinationen av sammansatt robusthet och kraftgenerering när aktin och mikrotubuli är närvarande vid jämförbara koncentrationer. Viktiga framväxande funktioner i denna region av formuleringsutrymme inkluderar förbättrad mekanisk styrka 26, samordnad rörelse av aktin och mikrotubuli26, stadig ihållande sammandragning och mesoskala omstrukturering17.
Här beskrivs protokoll för att konstruera och ställa in samtrasslade och tvärbundna kompositer av mikrotubuli och aktinfilament som skjuts ut ur jämvikt av myosin II minifilament och kinesinkluster som verkar på aktinfilament respektive mikrotubuli (figur 1). Dynamiken, strukturen och mekaniken i denna klass av kompositer kan ställas in av de relativa koncentrationerna av filament, motorer och tvärbindare för att uppvisa ett rikt fasutrymme av advektivt och turbulent flöde, isotrop sammandragning, acceleration, retardation, avblandning, förstyvning, avslappning och bristning. Fokus för detta arbete ligger på att förbereda och ställa in denna klass av aktiva cytoskelettkompositer. Men för att hjälpa forskare att jämföra och karakterisera de beskrivna aktiva kompositerna beskrivs också effektiva avbildningsmetoder som använder multispektral konfokalmikroskopi. Slutligen presenteras resultat av viktiga beräkningsanalysmetoder som kan användas för att mäta kompositernas dynamik, struktur och mekanik. Forskare uppmuntras att anta dessa metoder – som inkluderar differentiell dynamisk mikroskopi (DDM), rumslig bildautokorrelation (SIA) och partikelbildsvelocimetri (PIV) – eftersom de har optimerats för att karakterisera den komplexa dynamiken och strukturella mångfalden hos kompositerna 17,26,49.
Stegen som beskrivs nedan fokuserar på att förbereda kompositerna och avbilda dem med konfokalmikroskopi. Protokoll som beskriver dataanalys efter förvärv och optiska pincettmätningar finns i tidigare verk 17,26,48,50 och tillhandahålls på begäran. Allt material är listat i materialförteckningen som tillhandahålls.
Ett viktigt framsteg för det rekonstituerade systemet som beskrivs ovan är dess modularitet och tunabilitet, så användarna uppmuntras att modifiera koncentrationerna av proteiner, motorer, tvärbindare etc. för att passa deras önskade resultat, oavsett om det är att emulera en viss cellulär process eller konstruera ett material med specifik funktionalitet eller mekaniska egenskaper. Begränsningar av koncentrationsintervallet för aktin och tubulin ställs in vid den nedre gränsen av den kritiska koncentration som behövs för att polymerisera aktin (~ 0,2 μM) 57,58,59 och tubulin (~ 3 – 4 μM) 60, och vid den övre gränsen genom övergången till nematisk inriktning av aktinfilament (~ 90 μM) 61,62 eller mikrotubuli (~ 35 μM) 63 . Aktinmonomerer och tubulindimerer bör polymeriseras till filament tillsammans, snarare än att blandas ihop efter polymerisation, för att säkerställa att de bildar homogent interpenetrerande perkolerade nätverk som synergistiskt stöder varandra. Den nya dynamiken som kompositerna uppvisar är beroende av denna interaktion. Även om det i allmänhet är viktigt att följa alla steg som beskrivs i protokollet för att framgångsrikt reproducera de visade resultaten, är vissa steg mer krävande, medan andra har utrymme att ändra och justera för att passa specifika behov och tillgängliga resurser.
Ett viktigt steg för att säkerställa reproducerbara resultat är till exempel att förbereda och lagra reagenserna på rätt sätt i enlighet med riktlinjerna i materialförteckningen. Cytoskelettproteiner (aktin, tubulin, myosin, kinesin) är labila och bör alikvoteras, blixtfrysas med flytande kväve och förvaras vid -80 °C i alikvoter för engångsbruk. När alikvoterna har avlägsnats från -80 °C bör de förvaras på is. Cytoskelettproteiner behåller inte på ett tillförlitligt sätt funktionen efter ytterligare frys-tina cykler.
Mikrotubuli är känsligare för depolymerisation och denaturering än aktin. När tubulin har avlägsnats från -80 °C ska det förvaras på is före polymerisationen och användas inom 12 timmar. När de har polymeriserats bör mikrotubuli hållas vid rumstemperatur. Det är också viktigt att stabilisera mikrotubuli med taxol för att förhindra depolymerisation. Falloidinstabilisering av aktinfilament är också viktigt för att undertrycka det ATP-konsumerande aktinlöpbandet som konkurrerar med myosin- och kinesinaktivitet.
Ultracentrifugering av myosinmotorer är ett annat kritiskt steg, eftersom det tar bort inaktiva myosin döda huvuden. Att inte ta bort de enzymatiskt inaktiva monomererna resulterar i passiv tvärbindning av aktinnätverket och förlust av aktivitet. För att förlänga ATPas-aktiviteten hos motorer kan ett ATP-regenereringssystem såsom kreatinfosfat och kreatinfosfokinas64 införlivas.
Slutligen kräver upprätthållande av kompositaktivitet inhibering av adsorption av filament och motorer till provkammarens väggar, vilket kan uppnås genom passivering av mikroskopskydden och glidbanorna. Motorproteiner är särskilt benägna att adsorption, vilket resulterar i att kompositen dras till ytan av provkammaren, rör sig ut ur synfältet, kollapsar till 2D och inte längre genomgår aktivitet. Silanisering av täckglas och glidbanor är ett effektivt sätt att passivera ytorna och förhindra adsorption (se steg 1). En alternativ passiveringsmetod som används effektivt i in vitro-cytoskelettexperiment är att belägga ytan med ett lipid-dubbelskikt, liknande cellmembranet18. Denna metod är fördelaktig om man vill binda proteiner till ytan eller införa andra specifika protein-ytinteraktioner, eftersom dubbelskiktet kan funktionaliseras. För optiska pincettexperiment är passivering av mikrosfärerna också kritisk och kan uppnås genom beläggning av karboxylerade mikrosfärer med BSA eller PEG via karbodiimidkorsbindningskemi48.
Det finns några aspekter av de presenterade protokollen som forskare kan överväga att ändra för att passa deras behov. För det första kan forskare välja att ersätta icke-infödda biotin-NA-tvärbindare med biologiska tvärbindare, såsom alfa-aktinin eller MAP65 som tvärbinder aktin respektive mikrotubuli, 28,65,66. Användningen av icke-inbyggda tvärbindare i kompositerna som beskrivs här motiveras av deras förbättrade reproducerbarhet, stabilitet och tunabilitet jämfört med inbyggda tvärbindare. På grund av den starka biotin-NA-bindningen kan tvärbindare antas vara permanenta, snarare än de flesta inbyggda tvärbindare som tillfälligt binder med omfattande omsättningshastigheter. Dynamiken i övergående tvärbindning komplicerar att analysera bidragen från tvärbindare och motorer till dynamiken. Dessutom kan biotin-NA-länkar användas mångsidigt för att tvärbinda både aktin och mikrotubuli, liksom tvärbindningsaktin till mikrotubuli. På detta sätt kan en entydig jämförelse mellan tvärbindningsmotiv göras, vilket håller alla andra variabler (t.ex. tvärbindningsstorlek, bindningsaffinitet, stökiometri etc.) fasta. Slutligen är de reagenser som behövs för att införliva biotin-NA-länkar allmänt kommersiellt tillgängliga, väl karakteriserade och används ofta i många biofysiklaboratorier. En av de viktigaste styrkorna hos in vitro-plattformen som beskrivs här är dock dess modularitet, så forskare bör sömlöst kunna ersätta biotin-NA-länkar med inbyggda länkar om de väljer.
För det andra, i det aktuella protokollet, polymeriseras aktinmonomerer och tubulindimerer i filament tillsammans i ett centrifugrör innan de läggs till provkammaren. Att strömma lösningen av intrasslade trådformiga proteiner in i provkammaren kan orsaka flödesinriktning, särskilt av mikrotubuli, vilket bryter den önskade isotropin och homogeniteten hos kompositerna. Faktum är att ett stort framsteg i tidigare arbete med steady-state aktin-mikrotubulikompositer var förmågan att sampolymerisera aktin och mikrotubuli in situ (i provkammaren) för att säkerställa bildandet av isotropa interpenetrerande nätverk av aktin och mikrotubuli15,16,27. Att utvidga detta tillvägagångssätt till aktiva kompositer skulle dock kräva att motorerna tillsattes till provet före aktin- och tubulinpolymerisation och att hela provet inkuberades tillsammans vid 37 °C före experiment. Tester av denna variation av protokollet har resulterat i minskad aktinpolymerisation och ingen urskiljbar motorisk aktivitet, sannolikt på grund av konkurrerande ATPas-aktivitet och den långvariga 37 °C-inkubationen av motorerna. Lyckligtvis finns det ingen märkbar flödesjustering av kompositer när man följer de aktuella protokollen, vilket kan ses i figur 2, figur 3 och figur 6. Ändå uppmuntras forskare att utforma protokoll som möjliggör in situ-bildning av aktiva kompositer.
En annan punkt att överväga är fluorescensmärkningsschemat, vilket innebär att man märker alla aktinfilament och mikrotubuli i nätverket glest märkt. Denna märkningsmetod optimerades för att direkt visualisera nätverkets struktur snarare än att dra slutsatser om struktur och dynamik via spårfilament eller mikrosfärer. Avvägningen är dock att enskilda filament inte är starkt märkta och upplösbara. Ett tillvägagångssätt som forskare kan ta för att både lösa enstaka filament och visualisera nätverksstruktur är att dopa i förformade filament märkta med en annan fluorofor, så att både det omgivande nätverket och enskilda filament kan avbildas samtidigt. Men när man använder mer än två fluoroforer och excitations- / emissionskanaler är det ofta svårt att eliminera genomblödning mellan kanaler, så man måste vara försiktig när man väljer fluoroforer, filter och laserintensiteter.
En relaterad begränsning är oförmågan att visualisera myosin- eller kinesinmotorerna i kompositerna. De fluorescerande märkta aktinmonomererna och tubulindimererna som används är kommersiellt tillgängliga, medan visualisering av myosin eller kinesin i kompositer kräver intern märkning. Forskare uppmuntras att ta nästa steg för att märka motorer, som tidigare gjorts18,67, för att entydigt kunna koppla motorisk aktivitet och bindning till den dynamik och de strukturer som våra kompositer uppvisar.
Slutligen är det viktigt att notera att i det nuvarande protokollet kontrolleras inte kinesinaktivitetens början och varaktighet. Eftersom myosinaktiviteten styrs med hjälp av fotodeaktivering av blebbistatin, som beskrivits ovan, för att bygga in liknande ljusaktivering av kinesin, kan man införliva ljusaktiverad ATP.
För att bygga upp komplexiteten i de konstruktioner som beskrivs här, för att bättre efterlikna cellulära förhållanden och bredda det dynamiska struktur-funktionsparameterutrymmet, kommer framtida arbete att fokusera på att införliva mellanliggande filament, såsom vimentin68,69, liksom andra motorer som dynein13,70. Gelsolin kommer också att införlivas i olika koncentrationer för att kontrollera aktinlängd14, liksom tau-protein för att kontrollera mikrotubulistyvhet.
Sammanfattningsvis beskriver de presenterade protokollen hur man designar, skapar och karakteriserar dynamiken, strukturen och mekaniken hos cytoskelettinspirerade aktiva substanssystem, som innehåller två separata aktiva kraftgenererande komponenter som verkar på olika substrat i ett enda system. Denna avstämbara och modulära plattform ger rekonstitutionsinsatser ett viktigt steg närmare att efterlikna den cellulära cytoskeletten och erbjuder den unika förmågan att programmera dess egenskaper över ett brett fasutrymme genom att självständigt införliva, ta bort och ställa in de olika komponenterna. Dessutom är alla komponenter i detta mångsidiga system kommersiellt tillgängliga (se materialtabell), förutom kinesindimererna som renas i Ross Lab, som beskrivits tidigare50, och tillgängliga på begäran. Slutligen är all analyskod fritt tillgänglig via GitHub49 och är baserad på gratis programmeringsspråk och programvara (Python och Fiji). Den transparenta spridningen av protokoll för att utforma dessa system kommer förhoppningsvis att göra denna plattform mer tillgänglig för en mångsidig grupp användare med olika expertis, bakgrunder, institutionella tillhörigheter och forskningsmål.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner Maya Hendija och Dr. Jonathan Michel för hjälp med dataanalys, och Dr. Janet Sheung, Dr. Moumita Das och Dr. Michael Rust för hjälpsamma diskussioner och vägledning. Denna forskning stöddes av ett William M. Keck Foundation Research Grant och NSF DMREF Award (DMR 2119663) som tilldelades RMRA och JLR och National Institutes of Health R15 Grants (R15GM123420, 2R15GM123420-02) som tilldelades RMR-A och RJM.
(-)-Blebbistatin Abbreviation used in paper: blebbistatin |
Sigma Aldrich | B0560 | Stock Concentration: 200 μM in DMSO Storage: dessicated, in DMSO, -20ºC Stock and Experiment Recipes: dissolve 1 mg of powder to 200 μM in DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: limited shelf-life, typically stops functioning reliably after 3-4 months. purchase and prepare new solution every 3 months. |
1:20 488-tubulin:tubulin mixture Abbreviation used in paper: 5-488-tubulin |
NA | NA | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: mix tubulin and 488-tubulin at a 20:1 ratio, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light |
1:20 R-tubulin:tubulin mixture Abbreviation used in paper: 5-R-tubulin |
NA | NA | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: mix tubulin and rhodamine tubulin at a 20:1 ratio, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light |
actin (biotin): skeletal muscle Abbreviation used in paper: biotin-actin |
Cytoskeleton | AB07 | Stock Concentration: 1 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: (1) immediately prior to use dilute to 0.5 mg/ml in PEM, (2) once removed from -80ºC, store aliquot on ice at 4ºC for up to 1 week |
actin (rhodamine): rabbit skeletal muscle Abbreviation used in paper: R-actin |
Cytoskeleton | AR05 | Stock Concentration: 1.5 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1.5 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: once removed from -80ºC, store aliquot on ice at 4ºC, can be used for up to 1 week |
adenosine triphosphate Abbreviation used in paper: ATP |
Thermo Fisher Scientific | A1048 | Stock Concentration: 100 mM Storage: in solution (pH 7), -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconsitute in DI H20, bring pH to 7 with NaOH Storage, Handling, Troubleshooting Notes: routinely check pH and adjust as needed, hydrolyzes over time, replace every ~6-12 months |
AlexaFluor488 Phalloidin Abbreviation used in paper: 488-phalloidin |
Thermo Fisher Scientific | A12379 | Stock Concentration: 100 μM DMSO Storage: protected from light, dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 100 μM with DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 20 μM in PEM (1 μL in 4 μL PEM) |
AlexaFluor488–labeled actin Abbreviation used in paper: 488-actin |
Thermo Fisher Scientific | A12373 | Stock Concentration: 1.5 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 1.5 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: this item has been discontinued |
Basic Plasma Cleaner Abbreviation used in paper: plasma cleaner |
Harrick Plasma | PDC-32G | |
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film Abbreviation used in paper: transparent film |
Thermo Fisher Scientific | 13-374-5 | |
D-(+)-Glucose Abbreviation used in paper: |
Thermo Fisher Scientific | A1682836 | Stock Concentration: 100x Storage: store at stock concentration (100x) or 10x concentration, dessicated, at -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 4.5 mg/ml in DI H20 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: final concentration in solution should 45 μg/mL |
D-Biotin Abbreviation used in paper: biotin |
Fisher Scientific | BP232-1 | Stock Concentration: 1.02 mM in PEM Storage: dessicated, 4ºC |
deionized nanopure water Abbreviation used in paper: DI |
|||
Dimethyldichlorosilane Abbreviation used in paper: silane |
Thermo Fisher Scientific | D/3820/PB05 | Stock Concentration: 2% dissolved in Toulene |
Dithiothreitol Abbreviation used in paper: DTT |
Thermo Fisher Scientific | R0861 | Stock Concentration: 1 M in DMSO Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: dilute to 2 mM in PEM immediately before each experiment |
DMSO Anhydrous Abbreviation used in paper: DMSO |
Thermo Fisher Scientific | D12345 | |
F-Buffer Abbreviation used in paper: F-buffer |
NA | NA | Stock Concentration: 10x Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: 10 mM Imidazole (pH 7.0), 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0.2 mM ATP |
G-Buffer Abbreviation used in paper: G-buffer |
NA | NA | Stock Concentration: 10x Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: 2.0 mM Tris (pH 8), 0.2 mM ATP, 0.5 mM DTT, 0.1 mM CaCl2. Store at -20°C. |
glass microscope slide Abbreviation used in paper: slide |
Thermo Fisher Scientific | 22-310397 | |
Glucose oxidase + catalase + β-mercaptoethanol Abbreviation used in paper: GOC |
Sigma Aldrich | G2133-250KU, C1345, 63689 | Stock Concentration: 100x Storage: store at stock concentration (100x) or 10x concentration, dessicated, at -20ºC Stock and Experiment Recipes: For 100x: 4.3 mg/ml glucose oxidase, 0.7 mg/ml catalase, 0.5% v/v β-mercaptoethanol in DI H20 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: final concentration in solution should be: 0.005% β-mercaptoethanol, 43 μg/mL glucose oxidase, 7 μg/mL catalase |
glu-GOC oxygen scavenging system Abbreviation used in paper: glu-GOC |
NA | NA | Stock Concentration: 100x Storage: prepare fresh each time Stock and Experiment Recipes: mix equal parts Glu and GOC and add at 1/100 final sample volume immediately before imaging Storage, Handling, Troubleshooting Notes: prepare from Glu and GOC immediately before imaging |
Guanosine triphosphate Abbreviation used in paper: GTP |
Thermo Fisher Scientific | R0461 | Stock Concentration: 100 mM Storage: 100 μL aliquots at -20ºC |
Instant Mix 1-minute epoxy Abbreviation used in paper: epoxy |
Loctite | 1366072 | |
Kinesin-1 401 BIO 6x HIS Abbreviation used in paper: kinesin |
Prepared in JL Ross Lab at Syracuse University | NA | Stock Concentration: 8.87 μM in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Storage, Handling, Troubleshooting Notes: biotinylated dimers form kinesin clusters, each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC |
NeutrAvidin Abbreviation used in paper: NA |
Thermo Fisher Scientific | 31000 | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM |
No 1. glass coverslips (24 mm x 24 mm) Abbreviation used in paper: coverslip |
Thermo Fisher Scientific | 12-548-CP | |
Paclitaxel Abbreviation used in paper: Taxol |
Thermo Fisher Scientific | P3456 | Stock Concentration: 2 mM in DMSO Storage: protected from light, dessicated, -20ºC Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 2 mM with DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 200 μM in DMSO (0.4 μL in 3.6 μL DMSO) |
PEM-100 Abbreviation used in paper: PEM |
NA | NA | Stock Concentration: 1x Storage: room temperature (RT) Stock and Experiment Recipes: 100 mM K-PIPES (pH 6.8), 2 mM EGTA, 2 mM MgCl2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: use KOH to adjust pH to 6.8, recheck pH often and adjust accordingly |
phalloidin Abbreviation used in paper: phalloidin |
Thermo Fisher Scientific | P3457 | Stock Concentration: 100 μM in DMSO Storage: protected from light, dessicated, -20ºC, adhere closely to storage/handling conditions Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 100 μM with DMSO Storage, Handling, Troubleshooting Notes: susceptible to impurities in its preparation and denaturing, identifiable as large amorphous aggregates of actin in samples |
porcine brain tubulin Abbreviation used in paper: tubulin |
Cytoskeleton | T240 | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC |
Potassium Chloride Abbreviation used in paper: KCl |
Thermo Fisher Scientific | AM9640G | Stock Concentration: 4 M Storage: RT |
Rabbit skeletal actin Abbreviation used in paper: actin |
Cytoskeleton | AKL99 | Stock Concentration: 2 mg/ml in G-buffer Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute to 2 mg/ml in G-buffer, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: once removed from -80ºC, store aliquot on ice at 4ºC, can be used for up to 1 week |
Rabbit skeletal myosin II Abbreviation used in paper: myosin |
Cytoskeleton | MY02 | Stock Concentration: 10 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 10 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: monomers form minifilaments at low KCl, each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC |
Tubulin (biotin): porcine brain Abbreviation used in paper: biotin-tubulin |
Cytoskeleton | T333P | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: immediately prior to use dilute to 0.5 mg/ml in PEM |
Tubulin (fluorescent HiLyte 488): porcine brain Abbreviation used in paper: 488-tubulin |
Cytoskeleton | TL488M | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light |
tubulin (rhodamine): porcine brain Abbreviation used in paper: R-tubulin |
Cytoskeleton | TL590M | Stock Concentration: 5 mg/ml in PEM Storage: single use aliquots, -80ºC, avoid freeze-thaw cycles Stock and Experiment Recipes: reconstitute powder to 5 mg/ml in PEM, flash freeze with LN2 Storage, Handling, Troubleshooting Notes: each aliquot can be used for up to 12 hrs stored on ice at 4ºC, protect from light |
Tween 20 Abbreviation used in paper: Tween20 |
Thermo Fisher Scientific | J20605.AP | Stock Concentration: 1% v/v in DI H20 Storage: RT |
ultracentrifuge grade microtubes Abbreviation used in paper: Beckman-Coulter Optima Max XP |
Beckman Coultier | 343776 | Storage, Handling, Troubleshooting Notes: 8×34 mm PC |
UV light curing glue Abbreviation used in paper: UV glue |
Pharda | SKG-2869 |