Stima della resa dei composti sulla piastra TLC tramite la tecnica di illuminazione a LED blu
Summary
Il presente protocollo ha sviluppato un metodo per stimare la resa dei composti sulla piastra TLC utilizzando la tecnica di illuminazione blu-LED. I vantaggi di questo approccio sono che è sicuro, efficace, economico e consente al ricercatore di misurare più campioni contemporaneamente.
Abstract
La cromatografia su strato sottile (TLC) è una tecnica analitica accessibile che è stata ampiamente utilizzata nella ricerca di chimica organica per quantificare la resa di campioni sconosciuti. Il presente studio ha sviluppato un metodo efficace, economico e sicuro per stimare la resa dei campioni su una piastra TLC utilizzando l’illuminatore blu-LED. La lovastatina estratta da Aspergillus terreus è stato il composto di esempio utilizzato nel presente studio. Sono stati utilizzati modelli di regressione basati sullo standard di lovastatina per valutare la resa di lovastatina. Sono stati confrontati tre metodi: biotest, rilevamento UV e illuminazione blu-LED. Il risultato ha mostrato che il metodo di illuminazione blu-LED è significativamente più efficace in termini di tempo rispetto ai metodi di rilevamento UV e di bioanalisi. Inoltre, l’illuminazione blu-LED era un’opzione relativamente sicura a causa della preoccupazione dei rischi biologici nel metodo di bioanalisi (ad esempio, infezione microbica) e dell’esposizione ai raggi ultravioletti nel metodo di rilevamento UV. Rispetto ai metodi costosi che richiedono strumenti specializzati e formazione a lungo termine prima di lavorare in modo indipendente, come GC, HPLC e HPTLC, l’utilizzo dell’illuminatore blu-LED era un’opzione economica per stimare la resa dei campioni da una piastra TLC.
Introduction
La cromatografia su strato sottile (TLC) è ampiamente utilizzata come tecnica qualitativa e quantitativa nel campo della chimica organica 1,2,3. I principali vantaggi di TLC sono che fornisce un rilevamento rapido, requisiti di campionamento flessibili e non richiede attrezzature specializzate4. Ad oggi, anche se sono stati stabiliti molti approcci avanzati, TLC è ancora il metodo principale per identificare campioni sconosciuti in una miscela. Tuttavia, la sfida di questo approccio è la mancanza di attrezzature sicure e poco costose per quantificare la resa del campione, in particolare per lo sviluppo di laboratori con budget limitati. Il presente studio, quindi, mirava a sviluppare un metodo efficiente, sicuro ed economico combinato con TLC per stimare la resa dei campioni.
A differenza della TLC ad alte prestazioni (HPTLC), della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e della gascromatografia (GC) con requisiti rigorosi di campionamento, dispendiosi in termini di tempo e coinvolgimento di multistep per la preparazione del campione1,5, TLC ha mostrato diversi vantaggi. In primo luogo, per la preparazione del campione, l’HPLC e il GC non sono in grado di rilevare l’estratto grezzo perché l’estratto grezzo può ostruire la colonna di HPLC e GC. In secondo luogo, quando i campioni non sono adatti ai raggi UV (importante per l’analisi HPLC) o con bassa volatilità (importante per l’analisi GC), TLC può essere applicato a questi campioni e l’uso del reagente di visualizzazione rende i campioni isolati visibili su strati sottili 6,7,8. In terzo luogo, per gli utenti generici, HPLC e GC richiedono generalmente un tempo relativamente lungo di pre-formazione prima di lavorare in modo indipendente, rispetto a TLC. Inoltre, l’analisi quantitativa TLC, nota come TLC ad alte prestazioni (HPTLC), può digitalizzare le informazioni su una piastra TLC con uno scanner altamente sensibile. Tuttavia, il costo del sistema HPTLC è relativamente costoso. Pertanto, lo sviluppo di un approccio economico e rapido per quantificare i campioni sulla piastra TLC è un argomento importante.
Metodi simili sono stati sviluppati per la quantificazione della resa TLC; ad esempio, Johnson9 ha riportato una tecnica che consente la quantificazione dei campioni su una piastra TLC utilizzando uno scanner piano collegato a un computer. Nel 2001, El-Gindy et al.10 hanno sviluppato il metodo TLC-densitometrico, che è stato utilizzato per rilevare il composto con densità ottica, e la tecnica è stata applicata anche da Elkady et al.11. Nel 2007, Hess2 ha presentato il metodo digitally enhanced-TLC (DE-TLC) applicato per rilevare la resa di un composto su una piastra TLC utilizzando una fotocamera digitale combinata con luce UV. Hess ha anche confrontato le differenze di costo tra HPTLC e metodo DE-TLC e ha concluso che il metodo DE-TLC potrebbe essere utilizzato nei laboratori delle scuole superiori e universitari a causa del suo costo accessibile2. Tuttavia, il costo del metodo TLC-densitometrico era ancora costoso e il funzionamento della luce ultravioletta richiede un’adeguata pre-formazione nel caso in cui gli utenti potessero essere esposti alle radiazioni ultraviolette. Pertanto, compatibilmente con TLC, è auspicabile lo sviluppo di un metodo efficiente, sicuro ed economico per quantificare la resa del campione.
Il presente studio ha descritto un protocollo per rilevare il campione su una piastra TLC utilizzando l’illuminatore blu-LED e ha sviluppato un modello di regressione ad alta affidabilità (alto valore R-quadrato) per misurare le dimensioni delle bande e quindi determinare la resa del composto. Infine, è stato riscontrato che il metodo di illuminazione blu-LED è relativamente sicuro (vs. Metodo di rilevamento UV), economico (vs. GC, HPLC e HPTLC) e approccio efficace (rispetto al metodo di saggio biologico) per la quantificazione della resa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente studio ha descritto un nuovo approccio, l’illuminatore blu-LED, per quantificare i composti senza utilizzare apparecchiature costose e specializzate, come HPTLC, HPLC e metodo GC, e il metodo è stato confrontato con il saggio biologico e i metodi rilevati dai raggi UV per valutare le prestazioni di quantificazione. Di conseguenza, si è concluso che il metodo di illuminazione blu-LED è un protocollo relativamente sicuro ed efficace utilizzato per quantificare la resa di composti mirati sulla piastra TLC.</p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dal Ministero della Scienza e della Tecnologia, Taiwan (MOST 108-2320-B-110-007-MY3).
Materials
| American bacteriological Agar | Condalab | 1802.00 | |
| Aspergillus terreus | ATCC 20542 | ||
| Blue-LED illuminator | MICROTEK | Bio-1000F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | HERAEUS Megafuge 8 | |
| Compact UV lamp | UVP | UVGL-25 | |
| Ethyl Acetate | MACRON | MA-H078-10 | |
| Filter Paper 125mm | ADVANTEC | 60311102 | |
| ImageJ | NIH | Freeware | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Lovastatin standard | ACROS | A0404262 | |
| MiBio Fluo | MICROTEK | V1.04 | |
| n-Hexane | C-ECHO | HH3102-000000-72EC | |
| OriginPro | OriginLab | 9.1 | https://www.originlab.com/origin |
| Potato dextrose broth H | STBIO MEDIA | 110533 | |
| Rotary evaporator | EYELA | SB-1000 | |
| Sulfuric acid | Fluka | 30743-2.5L-GL | |
| TLC silica gel 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
| Trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | 10229873 | |
| Ultrasonic vibration machine | DELTA | DC600 |
Referências
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- Hess, A. V. I. Digitally enhanced thin-layer chromatography: An inexpensive, new technique for qualitative and quantitative analysis. Journal of Chemical Education. 84 (5), 842-847 (2007).
- Ullah, Q., Mohammad, A. Vitamins determination by TLC/HPTLC-a mini-review. Journal of Planar Chromatography – Modern TLC. 33 (5), 429-437 (2020).
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- El-Gindy, A., Ashour, A., Abdel-Fattah, L., Shabana, M. M. First derivative spectrophotometric, TLC-densitometric, and HPLC determination of acebutolol HCL in presence of its acid-induced degradation product. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24 (4), 527-534 (2001).
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