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Pesquisa do Câncer

잠재적인 방사능 감작제 또는 보호제를 평가하기 위한 모델로서의 제브라피시 유충

Published: August 25, 2022
doi:
10.3791/64233
, , , , ,
1Tumor microenvironment and animal models lab,Institute of Life Sciences, 2Vascular Biology lab,Institute of Life Sciences, 3Regional Centre for Biotechnology, 4School of Biotechnology,KIIT University

Summary

제브라피시는 최근 잠재적인 방사선 조절제를 검증하기 위한 모델로 활용되고 있습니다. 본 프로토콜은 방사선 기반 스크리닝 실험에 제브라피시 배아를 사용하는 세부 단계와 다양한 처리 및 방사선의 효과를 평가하기 위한 몇 가지 관찰 접근 방식을 설명합니다.

Abstract

제브라피쉬는 쉽게 관리할 수 있는 척추동물 모델 중 하나이며 독특하고 편리한 모델 시스템의 여러 기능을 보여주기 때문에 여러 종류의 연구에서 광범위하게 사용됩니다. 증식성이 높은 세포는 방사선으로 인한 DNA 손상에 더 취약하기 때문에 제브라피시 배아는 방사선 연구의 최전선 생체 내 모델입니다. 또한 이 모델은 주요 생물학적 사건 및 관련 반응과 함께 짧은 시간 내에 방사선 및 다양한 약물의 영향을 예측합니다. 여러 암 연구에서 제브라피시를 사용했으며, 이 프로토콜은 방사선 요법 및 암의 맥락에서 방사선 조절제의 사용을 기반으로 합니다. 이 방법은 방사선 조사 및 대조군(비방사선 조사) 배아에 대한 다양한 약물의 효과를 검증하는 데 쉽게 사용할 수 있으므로 약물을 방사선 감작 또는 보호 약물로 식별할 수 있습니다. 이 방법론은 대부분의 약물 스크리닝 실험에 사용되지만 X선 방사선 노출을 배경으로 한 실험 및 독성 평가의 세부 사항이 제한적이거나 간략하게만 다루어져 수행이 어렵습니다. 이 프로토콜은 이 문제를 해결하고 자세한 그림과 함께 절차 및 독성 평가에 대해 설명합니다. 이 절차는 방사선 연구 및 방사선 기반 약물 스크리닝에 제브라피시 배아를 사용하여 신뢰성과 재현성을 높이는 간단한 접근 방식을 설명합니다.

Introduction

제브라피시(Danio rerio)는 지난 30년 동안 연구에 널리 사용되어 온 잘 알려진 동물 모델입니다. 실험실 조건에서 사육 및 번식하기 쉬운 작은 민물고기입니다. 제브라피쉬는 다양한 발달 및 독성 연구에 광범위하게 사용되어 왔다 1,2,3,4,5,6,7,8. 제브라피쉬는 번식력이 높고 배아 생성이 짧습니다. 배아는 다양한 발달 단계를 추적하는데 적합하고, 시각적으로 투명하며, 다양한 유전자 조작 및 고처리량 스크리닝 플랫폼 9,10,11,12,13,14에 적응할 수 있다. 또한, 제브라피쉬는 입체 또는 형광 현미경 7,15,16을 사용하여 다양한 독성 물질 또는 요인이 존재할 때 발달 과정과 다양한 기형을 쉽게 연구할 수 있는 토토 및 라이브 이미징을 제공합니다.

방사선 치료는 암 치료에 사용되는 주요 치료 방법 중 하나입니다 17,18,19,20,21,22,23,24. 그러나 암 방사선 치료는 악성 세포를 죽이면서 정상적이고 건강한 세포가 죽지 않도록 보호하거나 고에너지 방사선을 포함하는 치료 중에 인간의 건강을 보호하기 위해 잠재적인 방사선 보호기를 필요로 한다 25,26,27,28,29. 반대로, 강력한 방사성 감작제는 특히 표적 및 정밀 치료에서 악성 세포를 죽이기 위한 방사선의 효율을 증가시키기 위해 연구되고 있다30,31,32,33. 따라서 강력한 방사선 보호기 및 감작제를 검증하기 위해 준고처리량 약물 스크리닝에 적합하고 방사선 효과를 측정 가능하게 나타내는 모델이 많이 요청됩니다. 사용 가능한 몇 가지 모델이 방사선 연구에 사용되며 약물 스크리닝 실험에 포함됩니다. 그러나 고등 척추동물과 가장 일반적으로 사용되는 생체 내 모델인 마우스조차도 이러한 모델로 이러한 스크리닝 실험을 설계하는 데 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며 도전적이기 때문에 대규모 약물 스크리닝에 적합하지 않습니다. 유사하게, 세포 배양 모델은 다양한 고처리량 약물 스크리닝 실험(34,35)에 이상적이다. 그러나 세포 배양과 관련된 실험은 배양 중인 세포가 성장 조건 및 역학에 따라 거동을 현저하게 변화시킬 수 있기 때문에 항상 실용적이거나 재현성이 높거나 신뢰할 수 있는 것은 아닙니다. 또한, 다양한 세포 유형은 차등 방사선 감작을 나타냅니다. 특히, 2D 및 3D 세포 배양 시스템은 전체 유기체 시나리오를 나타내지 않으며, 따라서 얻어진 결과는 방사성 독성의 실제 수준을 요약하지 않을 수 있다36,37. 이와 관련하여 제브라피시는 새로운 방사능 감작제 및 방사능 보호제를 스크리닝하는 데 몇 가지 이점을 제공합니다. 취급 용이성, 큰 클러치 크기, 짧은 수명, 빠른 배아 발달, 배아 투명성 및 작은 몸 크기는 제브라피시를 대규모 약물 스크리닝에 적합한 모델로 만듭니다. 위의 장점으로 인해 짧은 시간에 실험을 쉽게 반복할 수 있으며 멀티웰 플레이트의 해부 현미경으로 효과를 쉽게 관찰할 수 있습니다. 따라서 제브라피시는 방사선 연구와 관련된 약물 스크리닝 연구에서 인기를 얻고 있습니다38,39.

방사선 조절제를 스크리닝하는 진정한 모델로서의 제브라피쉬의 잠재력은 다양한 연구에서 입증되었습니다 40,41,42,43,44,45. 제브라피시 모델에서 나노입자 DF1, 아미포스틴(WR-2721), DNA 복구 단백질 KU80 및 ATM, 이식된 조혈모세포와 같은 잠재적 방사성 변형제의 방사선 보호 효과와 플라보피리돌 및 AG1478과 같은 방사성 감작제의 효과가 보고되었다 19,41,42,43,44,45,46. 동일한 시스템을 사용하여 DF-1(풀러렌 나노입자)의 방사능 보호 효과를 전신 및 장기 특이적 수준에서 평가했으며, 방사능 보호기 스크리닝을 위한 제브라피시 배아의 사용도 추가로 조사되었습니다47. 최근 켈룰룻 꿀은 제브라피시 배아에서 방사성 보호제로 보고되었으며, 배아 생존율을 높이고 장기 특이적 손상, 세포 DNA 손상 및 세포사멸을 예방하는 것으로 밝혀졌다48.

유사하게, Hantzsch의 반응을 통해 생성된 중합체의 방사능 보호 효과는 고처리량 스크리닝에서 제브라피시 배아에서 확인되었으며, 보호는 주로 DNA 손상으로부터 세포를 보호함으로써 부여되었습니다49. 이전 연구들 중 하나에서, 친유성 스타틴 플루바스타틴(lipophilic statin fluvastatin)은 이러한 접근법을 가진 제브라피시 모델을 사용하여 잠재적인 방사성 감작제로서 발견되었다50. 유사하게, 금 나노 입자는 이상적인 방사성 감작제로 간주되며 많은 연구에서 사용되었습니다51,52.

제브라피쉬의 배아 발달은 단세포 접합체가 분열하여 실체현미경으로 쉽게 식별할 수 있는 2개의 세포, 4개의 세포, 8개의 세포, 16개의 세포, 32개의 세포 및 64개의 세포를 형성하는 초기 3시간 동안의 절단을 포함합니다. 그런 다음 128개의 세포(수정 후 2.25시간, hpf)가 있는 배반구 단계에 도달하며, 여기서 세포는 15분마다 두 배로 증가하여 256개 세포(2.5hpf), 512개 세포(2.75hpf) 및 단 3시간 만에 1,000+ 세포에 도달합니다(그림 1). 4 시간에, 난자는 구체 단계에 도달하고, 배아 질량 7,53,54에 돔 모양의 형성이 뒤따른다. 제브라피쉬의 위축은 5.25hpf54에서 시작하여 쉴드 단계에 도달합니다. 쉴드는 생식 고리의 한쪽으로 세포가 빠르게 수렴하는 움직임을 명확하게 나타내며(그림 1), 쉽게 식별할 수 있는 배아의 두드러지고 뚜렷한 단계입니다53,54. 배아에 대한 방사선 노출은 발달의 어느 단계에서나 이루어질 수 있지만, 배아 형성 중 방사선 노출은 방사선 유발 독성의 더 나은 판독을 용이하게 하는 보다 뚜렷한 형태학적 변화를 가질 수 있다55; 유사하게, 배아에 대한 약물 투여는 빠르면 2 HPF54부터 시작될 수 있다.

Protocol

본 연구는 부바네스와르 생명과학연구소 기관동물윤리위원회(Institutional Animal Ethical Committee)의 사전 승인과 지침에 따라 수행되었다. 모든 제브라피시 유지 및 번식은 28.5°C의 주변 어류 배양 시설에서 수행되었으며, 배아는 28.5°C의 생물학적 산소 요구량(BOD) 인큐베이터에서 유지되었습니다. 여기서, 제브라피시 AB 균주를 사용하였고, Kimmel et al.54에 따라 병기를 수행하였다. X선…

Representative Results

프로토콜의 전체 레이아웃은 그림 2에 나와 있습니다. 방사선의 영향 및 선량에 따른 특성화는 다음과 같은 분석을 통해 평가되었습니다. X선 유도 독성 평가실체현미경을 사용하여 약물 처리 및/또는 방사선 치료 후 다음과 같은 이상을 평가하고 특성화했습니다. OECD 가이드라인 61에 따르면, 어류의 독성 평가를 위해 배아?…

Discussion

제브라피시는 여러 유형의 암 연구를 포함한 많은 연구에서 귀중한 모델로 사용됩니다. 이 모델은 대규모 약물 스크리닝(67,68)을 위한 유용한 플랫폼을 제공한다. 다른 독성 평가 방법과 마찬가지로 방사선 및/또는 약물 처리 시 주요 생물학적 변화에 대한 정량적 평가는 이 프로토콜의 가장 중요한 부분입니다. 이러한 종류의 연구에서 생존이 독성을 ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SS의 연구실과 RKS의 연구실은 DBT와 인도의 SERB로부터 보조금을 지원받고 있습니다. APM은 인도 정부의 ICMR 펠로우십 수혜자입니다. DP는 인도 정부의 CSIR 펠로우십 수혜자입니다. UN은 인도 정부의 DST-Inspire 펠로우십 수혜자입니다. 그림 2 는 Biorender(https://biorender.com)를 사용하여 생성되었습니다.

Materials

6 Well plates Corning CLS3335 Polystyrene
B.O.D Incubator Oswald JRIC-10
Calcium Chloride Fisher Scientific 10101-41-4
Dissecting Microscope Zeiss Stemi 2000
External Tank for the 1.0 L Breeding Tank Tecniplast ZB10BTE Polycarbonate
Glass petriplates Borosil 3165A75 Glass
GraphpadPrism GraphPad Software, Inc. Version 5.01
Kline concavity slides Himedia GW092-1PK Glass
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M8266
Methylene blue hydrate Sigma-Aldrich 66720-100G
Parafilm Tarsons 380020 Paraffin film
Pasteur pipettes Himedia PW1212-1X500NO Polyethylene plastic
Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank Tecniplast ZB10BTI Polycarbonate
Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank Tecniplast ZB10BTD Polycarbonate
Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank Tecniplast ZB10BTL Polycarbonate
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5655
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653-5KG
Sodium hydroxide pellet SRL 1949181
Stereo Microscope Leica M205FA Leica Model/PN MDG35/10 450 125
X-Rad 225 Precision X-Ray Precision X-Ray X-RAD 225XL
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Mohapatra, A. P., Parida, D., Mohapatra, D., Nayak, U., Swain, R. K., Senapati, S. Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors. J. Vis. Exp. (186), e64233, doi:10.3791/64233 (2022).
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