Este protocolo descreve culturas organotípicas de longo prazo do córtex humano adulto combinadas com transplante intracortical ex vivo de progenitores corticais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas, que apresentam uma nova metodologia para testar ainda mais terapias baseadas em células-tronco para distúrbios neurodegenerativos humanos.
Os distúrbios neurodegenerativos são comuns e heterogêneos em termos de sintomas e afetação celular, tornando seu estudo complicado devido à falta de modelos animais adequados que imitam totalmente as doenças humanas e a baixa disponibilidade de tecido cerebral humano post-mortem. A cultura de tecido nervoso humano adulto oferece a possibilidade de estudar diferentes aspectos de distúrbios neurológicos. Mecanismos moleculares, celulares e bioquímicos poderiam ser facilmente abordados neste sistema, bem como testar e validar drogas ou diferentes tratamentos, como terapias baseadas em células. Este método combina culturas organotípicas de longo prazo do córtex humano adulto, obtidas de pacientes epilépticos submetidos a cirurgia ressectiva, e transplante intracortical ex vivo de progenitores corticais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas. Este método permitirá o estudo da sobrevivência celular, diferenciação neuronal, a formação de entradas e saídas sinápticas e as propriedades eletrofisiológicas de células derivadas de humanos após o transplante em tecido cortical humano adulto intacto. Essa abordagem é um passo importante antes do desenvolvimento de uma plataforma de modelagem de doenças humanas 3D que aproximará a pesquisa básica da tradução clínica de terapias baseadas em células-tronco para pacientes com diferentes distúrbios neurológicos e permitirá o desenvolvimento de novas ferramentas para a reconstrução de circuitos neurais danificados.
Distúrbios neurodegenerativos, como a doença de Parkinson, a doença de Alzheimer ou o acidente vascular cerebral isquêmico, são um grupo de doenças que compartilham a característica comum de mau funcionamento neuronal ou morte. Eles são heterogêneos em termos de área do cérebro e população neuronal afetada. Infelizmente, os tratamentos para essas doenças são escassos ou de eficácia limitada devido à falta de modelos animais que imitem o que ocorre no cérebro humano 1,2. A terapia com células-tronco é uma das estratégias mais promissoras para a regeneração cerebral3. A geração de progenitores neuronais a partir de células-tronco de diferentes fontes tem sido muito desenvolvida nos últimos anos 4,5. Publicações recentes mostraram que células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPS) derivadas de células neuroepiteliais auto-renovadoras a longo prazo (lt-NES), seguindo um protocolo de diferenciação cortical e após transplante intracortical em um modelo de rato com acidente vascular cerebral isquêmico afetando o córtex somatossensorial, geram neurônios corticais maduros. Além disso, os neurônios derivados do enxerto receberam conexões sinápticas aferentes e eferentes dos neurônios hospedeiros, mostrando sua integração na rede neuronal de ratos 6,7. Os axônios derivados do enxerto foram mielinizados e encontrados em diferentes áreas do cérebro de ratos, incluindo a área peri-infarto, corpo caloso e córtex somatossensorial contralateral. Mais importante ainda, o transplante derivado de células iPS reverteu déficits motores em animais com AVC7.
Mesmo que os modelos animais ajudem a estudar a sobrevivência do transplante, a integração neuronal e o efeito das células enxertadas nas funções motoras e cognitivas, faltam informações sobre a interação entre as células humanas (enxerto-hospedeiro) nesse sistema 8,9. Por esta razão, um método combinado de cultura organotípica do cérebro humano a longo prazo com o transplante ex vivo de progenitores neuronais derivados de células iPS humanas é descrito aqui. As culturas organotípicas do cérebro humano obtidas a partir de ressecções neurocirúrgicas são modelos 3D fisiologicamente relevantes do cérebro que permitem aos pesquisadores aumentar sua compreensão dos circuitos do sistema nervoso central humano e a maneira mais precisa de testar tratamentos para distúrbios cerebrais humanos. No entanto, não foram realizadas pesquisas suficientes nesse contexto e, na maioria dos casos, culturas organotípicas cerebrais do hipocampo humano têm sido utilizadas10,11. O córtex cerebral é afetado por diversos distúrbios neurodegenerativos, como o AVC isquêmico12 ou a doença de Alzheimer13, por isso é importante ter um sistema 3D cortical humano que nos permita expandir nossos conhecimentos e testar e validar diferentes estratégias terapêuticas. Vários estudos nos últimos anos têm utilizado culturas de tecido cortical humano adulto (hACtx) para modelar doenças cerebrais humanas 14,15,16,17,18,19; no entanto, informações limitadas estão disponíveis no contexto da terapia com células-tronco. Dois estudos já demonstraram a viabilidade do sistema aqui descrito. Em 2018, células-tronco embrionárias humanas programadas com diferentes fatores de transcrição e transplantadas para o tecido hACtx demonstraram dar origem a neurônios corticais maduros que poderiam se integrar em redes corticais humanas adultas20. Em 2020, o transplante de células lt-NES para o sistema organotípico humano revelou sua capacidade de se diferenciar em neurônios corticais maduros e específicos de camadas com as propriedades eletrofisiológicas dos neurônios funcionais. Os neurônios enxertados estabeleceram contatos sinápticos aferentes e eferentes com os neurônios corticais humanos nas fatias cerebrais adultas, corroborado pelo rastreamento monossináptico retrógrado do vírus da raiva, registros de patch-clamp de células inteiras e microscopia imunoeletrônica21.
Obter fatias hACtx de qualidade suficientemente alta é a etapa mais crítica neste protocolo. O tecido cortical é obtido de pacientes epilépticos submetidos à cirurgia ressectiva24. A qualidade do tecido ressecado, bem como o tempo de exposição do tecido entre a ressecção e a cultura, é fundamental; quanto mais rápido o tecido for transferido da sala de cirurgia para o laboratório e cortado, mais ideal será a cultura organotípica. Idealmente, o tecido deve ser cortad…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho é apoiado por doações do Conselho Sueco de Pesquisa, da Fundação Sueca do Cérebro, da Fundação Sueca de AVC, da Região de Skåne, da Fundação Thorsten e Elsa Segerfalk e da Iniciativa do Governo Sueco para Áreas de Pesquisa Estratégicas (StemTherapy).
Tissue Cutting and electrophysiology | |||
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
HEPES | AppliChem | A1069 | |
Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2×91 | |
Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
Plastic Petri dish | Any suitable | ||
Potassium chloride | Merck | 104936 | |
Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
Vibratome | Leica | VT1200 S | |
RINSING SOLUTION | |||
D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
HEPES | AppliChem | A1069 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
Forceps | Any suitable | ||
Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
GENERATION OF lt-NES cells | |||
2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
Paint brush | Any suitable | ||
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
Distilled water | |||
Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
Sodium citrate | |||
Distilled water | |||
Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |