Præsenteret her er en detaljeret immunohistokemiprotokol til at identificere, validere og målrette funktionelt relevante caspaser i komplekse væv.
Familien af caspaser er kendt for at formidle mange cellulære veje ud over celledød, herunder celledifferentiering, axonal pathfinding og spredning. Siden identifikationen af familien af celledødsproteaser har der været en søgning efter værktøjer til at identificere og udvide funktionen af specifikke familiemedlemmer i udviklings-, sundheds- og sygdomstilstande. Imidlertid er mange af de aktuelt kommercielt tilgængelige caspase-værktøjer, der er meget udbredt, ikke specifikke for den målrettede caspase. I denne rapport afgrænser vi den tilgang, vi har brugt til at identificere, validere og målrette caspase-9 i nervesystemet ved hjælp af en ny hæmmer og genetiske tilgange med immunohistokemiske udlæsninger. Specifikt brugte vi det retinale neuronale væv som en model til at identificere og validere tilstedeværelsen og funktionen af caspaser. Denne tilgang muliggør forhør af celletypespecifikke apoptotiske og ikke-apoptotiske caspase-9-funktioner og kan anvendes på andre komplekse væv og caspaser af interesse. At forstå caspasernes funktioner kan bidrage til at udvide den nuværende viden inden for cellebiologi og kan også være en fordel at identificere potentielle terapeutiske mål på grund af deres involvering i sygdom.
Caspaserne er en familie af proteaser, der regulerer udviklingscelledød, immunrespons og afvigende celledød i sygdom 1,2. Mens det er velkendt, at medlemmer af caspase-familien induceres i en række neurodegenerative sygdomme, er det mere udfordrende at forstå, hvilken caspase der driver sygdomspatologi3. Sådanne undersøgelser kræver værktøjer til at identificere, karakterisere og validere funktionen af individuelle caspase-familiemedlemmer. Det er vigtigt at analysere de relevante individuelle caspaser både fra et mekanistisk og et terapeutisk synspunkt, da litteraturen har flere undersøgelser, der giver bevis for caspases forskellige roller 4,5. Hvis målet er at målrette en caspase i en sygdom til en terapeutisk fordel, er det således afgørende at have specifik målretning af det eller de relevante familiemedlemmer. Traditionelle teknikker til påvisning af caspaseniveauer i væv omfatter western blotting og enzymatiske og fluorometriske tilgange 3,6. Ingen af disse foranstaltninger tillader imidlertid cellespecifik påvisning af caspaseniveauer, og i nogle scenarier kan spaltede caspaser ofte ikke påvises ved traditionelle proteinanalyseforanstaltninger. Det er kendt, at caspaser kan spille forskellige apoptotiske og ikke-apoptotiske roller i samme væv7, derfor er omhyggelig karakterisering af cellespecifikke caspaseniveauer nødvendig for nøjagtig forståelse af udviklings- og sygdomsveje.
Denne undersøgelse viser caspaseaktivering og funktion i en model af neurovaskulær hypoxi-iskæmi – retinal veneokklusion (RVO)7,8. I et komplekst væv som nethinden er der flere celletyper, der kan påvirkes af hypoxi-iskæmi induceret i RVO, herunder gliaceller, neuroner og vaskulatur7. I den voksne musenethinde er der meget lidt udtryk for caspaser tydeligt i sundt væv, målt ved immunhistokemi (IHC)7, men det er ikke tilfældet under udvikling9 eller i modeller af retinal sygdom10,11. IHC er en teknik, der er veletableret i biomedicinsk forskning og har muliggjort validering af sygdoms- og patologiske mål, identifikation af nye roller gennem rumlig lokalisering og kvantificering af proteiner. I tilfælde, hvor spaltede caspaseprodukter ikke kan påvises ved western blot eller fluorometrisk analyse, eller den specifikke celleplacering af forskellige caspaser eller forhør af caspase-signalveje gennem lokalisering, skal IHC anvendes.
For at bestemme de caspase(s), der er funktionelt relevante i RVO, blev IHC anvendt med validerede antistoffer mod caspaser og cellulære markører. De tidligere undersøgelser udført i laboratoriet viste, at caspase-9 hurtigt blev aktiveret i en model af iskæmisk slagtilfælde og hæmning af caspase-9 med en meget specifik hæmmer beskyttet mod neuronal dysfunktion og død12. Fordi nethinden er en del af centralnervesystemet (CNS), fungerer det som et modelsystem til at forespørge og yderligere undersøge caspase-9’s rolle i neurovaskulære skader13. Til dette formål blev musemodellen af RVO brugt til at studere den cellespecifikke placering og fordeling af caspase-9 og dens implikation i neurovaskulær skade. RVO er en almindelig årsag til blindhed hos voksne i den erhvervsaktive alder, der skyldes vaskulær skade14. Det blev konstateret, at caspase-9 blev udtrykt på en ikke-apoptotisk måde i endotelceller, men ikke i neuroner.
Som væv har nethinden den fordel, at den visualiseres som enten en fladmonteret, der tillader påskønnelse af de vaskulære netværk, eller som tværsnit, der fremhæver de neuronale retinale lag. Kvantificering af caspaseproteinekspression i tværsnit giver kontekst, om hvilken caspase der potentielt er kritisk i retinal neuronal forbindelse og synsfunktion ved at identificere lokaliseringen af caspase (r) i nethinden. Efter identifikation og validering opnås målretning af den caspase af interesse ved hjælp af inducerbar cellespecifik sletning af den identificerede caspase. For potentielle terapeutiske undersøgelser blev relevansen af de interesserede caspaser testet ved hjælp af specifikke værktøjer til at hæmme den aktiverede caspase. Til caspase-9 blev der anvendt en celle permeant meget selektiv hæmmer 7,15, Pen1-XBIR3. Til denne rapport blev der anvendt 2 måneder gammel, mandlig C57BL/6J-stamme og tamoxifen-inducerbar endotelcaspase-9 knockout (iEC Casp9KO) stamme med en C57BL/6J-baggrund. Disse dyr blev udsat for musemodellen af RVO, og C57BL/6J blev behandlet med den selektive caspase-9-hæmmer, Pen1-XBir3. Den beskrevne metode kan anvendes på andre sygdomsmodeller i de centrale og perifere systemer 7,15.
Caspaser er en flermedlemsfamilie af proteaser, der bedst studeres for deres roller i celledød og betændelse; for nylig er der imidlertid blevet afdækket en række ikke-dødsfunktioner for nogle familiemedlemmer 4,5. Meget af vores forståelse af caspase-funktion stammer fra arbejde i cellekultur og fra inferentielle data fra menneskelig sygdom. Mens det er værdsat, at der er afvigende induktion, aktivering eller inaktivering af caspaser i sygdom, har det væ…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) tilskud DGE – 1644869 og National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) fra National Institutes of Health (NIH), tildelingsnummer F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (til CKCO), National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (til AMP), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 til CMT) og Forsvarsministeriets Hær/Luftvåben (DURIP til CMT).
anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
FIJI 2.3.0 | open source | ||
Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
Forcep | Roboz | RS-5015 | |
iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
Perfusion pump | Masterflex | ||
Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
Prism 9.1 | GraphPad | ||
Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |