Kvantificering af immunostained Caspase-9 i retinalt væv

Summary

Præsenteret her er en detaljeret immunohistokemiprotokol til at identificere, validere og målrette funktionelt relevante caspaser i komplekse væv.

Abstract

Familien af caspaser er kendt for at formidle mange cellulære veje ud over celledød, herunder celledifferentiering, axonal pathfinding og spredning. Siden identifikationen af familien af celledødsproteaser har der været en søgning efter værktøjer til at identificere og udvide funktionen af specifikke familiemedlemmer i udviklings-, sundheds- og sygdomstilstande. Imidlertid er mange af de aktuelt kommercielt tilgængelige caspase-værktøjer, der er meget udbredt, ikke specifikke for den målrettede caspase. I denne rapport afgrænser vi den tilgang, vi har brugt til at identificere, validere og målrette caspase-9 i nervesystemet ved hjælp af en ny hæmmer og genetiske tilgange med immunohistokemiske udlæsninger. Specifikt brugte vi det retinale neuronale væv som en model til at identificere og validere tilstedeværelsen og funktionen af caspaser. Denne tilgang muliggør forhør af celletypespecifikke apoptotiske og ikke-apoptotiske caspase-9-funktioner og kan anvendes på andre komplekse væv og caspaser af interesse. At forstå caspasernes funktioner kan bidrage til at udvide den nuværende viden inden for cellebiologi og kan også være en fordel at identificere potentielle terapeutiske mål på grund af deres involvering i sygdom.

Introduction

Caspaserne er en familie af proteaser, der regulerer udviklingscelledød, immunrespons og afvigende celledød i sygdom ^1,2. Mens det er velkendt, at medlemmer af caspase-familien induceres i en række neurodegenerative sygdomme, er det mere udfordrende at forstå, hvilken caspase der driver sygdomspatologi³. Sådanne undersøgelser kræver værktøjer til at identificere, karakterisere og validere funktionen af individuelle caspase-familiemedlemmer. Det er vigtigt at analysere de relevante individuelle caspaser både fra et mekanistisk og et terapeutisk synspunkt, da litteraturen har flere undersøgelser, der giver bevis for caspases forskellige roller ^4,5. Hvis målet er at målrette en caspase i en sygdom til en terapeutisk fordel, er det således afgørende at have specifik målretning af det eller de relevante familiemedlemmer. Traditionelle teknikker til påvisning af caspaseniveauer i væv omfatter western blotting og enzymatiske og fluorometriske tilgange ^3,6. Ingen af disse foranstaltninger tillader imidlertid cellespecifik påvisning af caspaseniveauer, og i nogle scenarier kan spaltede caspaser ofte ikke påvises ved traditionelle proteinanalyseforanstaltninger. Det er kendt, at caspaser kan spille forskellige apoptotiske og ikke-apoptotiske roller i samme væv⁷, derfor er omhyggelig karakterisering af cellespecifikke caspaseniveauer nødvendig for nøjagtig forståelse af udviklings- og sygdomsveje.

Denne undersøgelse viser caspaseaktivering og funktion i en model af neurovaskulær hypoxi-iskæmi – retinal veneokklusion (RVO)^7,8. I et komplekst væv som nethinden er der flere celletyper, der kan påvirkes af hypoxi-iskæmi induceret i RVO, herunder gliaceller, neuroner og vaskulatur⁷. I den voksne musenethinde er der meget lidt udtryk for caspaser tydeligt i sundt væv, målt ved immunhistokemi (IHC)⁷, men det er ikke tilfældet under udvikling⁹ eller i modeller af retinal sygdom^10,11. IHC er en teknik, der er veletableret i biomedicinsk forskning og har muliggjort validering af sygdoms- og patologiske mål, identifikation af nye roller gennem rumlig lokalisering og kvantificering af proteiner. I tilfælde, hvor spaltede caspaseprodukter ikke kan påvises ved western blot eller fluorometrisk analyse, eller den specifikke celleplacering af forskellige caspaser eller forhør af caspase-signalveje gennem lokalisering, skal IHC anvendes.

For at bestemme de caspase(s), der er funktionelt relevante i RVO, blev IHC anvendt med validerede antistoffer mod caspaser og cellulære markører. De tidligere undersøgelser udført i laboratoriet viste, at caspase-9 hurtigt blev aktiveret i en model af iskæmisk slagtilfælde og hæmning af caspase-9 med en meget specifik hæmmer beskyttet mod neuronal dysfunktion og død¹². Fordi nethinden er en del af centralnervesystemet (CNS), fungerer det som et modelsystem til at forespørge og yderligere undersøge caspase-9’s rolle i neurovaskulære skader¹³. Til dette formål blev musemodellen af RVO brugt til at studere den cellespecifikke placering og fordeling af caspase-9 og dens implikation i neurovaskulær skade. RVO er en almindelig årsag til blindhed hos voksne i den erhvervsaktive alder, der skyldes vaskulær skade¹⁴. Det blev konstateret, at caspase-9 blev udtrykt på en ikke-apoptotisk måde i endotelceller, men ikke i neuroner.

Som væv har nethinden den fordel, at den visualiseres som enten en fladmonteret, der tillader påskønnelse af de vaskulære netværk, eller som tværsnit, der fremhæver de neuronale retinale lag. Kvantificering af caspaseproteinekspression i tværsnit giver kontekst, om hvilken caspase der potentielt er kritisk i retinal neuronal forbindelse og synsfunktion ved at identificere lokaliseringen af caspase (r) i nethinden. Efter identifikation og validering opnås målretning af den caspase af interesse ved hjælp af inducerbar cellespecifik sletning af den identificerede caspase. For potentielle terapeutiske undersøgelser blev relevansen af de interesserede caspaser testet ved hjælp af specifikke værktøjer til at hæmme den aktiverede caspase. Til caspase-9 blev der anvendt en celle permeant meget selektiv hæmmer ^7,15, Pen1-XBIR3. Til denne rapport blev der anvendt 2 måneder gammel, mandlig C57BL/6J-stamme og tamoxifen-inducerbar endotelcaspase-9 knockout (iEC Casp9KO) stamme med en C57BL/6J-baggrund. Disse dyr blev udsat for musemodellen af RVO, og C57BL/6J blev behandlet med den selektive caspase-9-hæmmer, Pen1-XBir3. Den beskrevne metode kan anvendes på andre sygdomsmodeller i de centrale og perifere systemer ^7,15.

Protocol

Denne protokol følger Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) erklæring til brug af dyr i oftalmisk og synsforskning. Gnaverforsøg blev godkendt og overvåget af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Columbia University. 1. Fremstilling af retinalt væv og kryosektion Aflivning af dyrene ved administration af intraperitonealbedøvelse (ketamin (80-100 mg/kg) og xylazin (5-10 mg/kg)) og perfusér musene udsat for RVO (se<sup cl…

Representative Results

Den beskrevne protokol giver brugeren mulighed for at analysere og kvantificere caspase-9 niveauer i retinalvævet. Derudover præsenterer den værktøjer til yderligere at identificere, validere og specifikt målrette caspase-9 og downstream substrater. De opsummerede trin muliggør kvantificerbar analyse af caspaseniveauer og cellulær specificitet i fluorescerende fotomikrografer. Alle tal viser repræsentative fotomikrografer og kvantificering af de angivne caspaseniveauer i den samlede nethinde, endotelceller og neu…

Discussion

Caspaser er en flermedlemsfamilie af proteaser, der bedst studeres for deres roller i celledød og betændelse; for nylig er der imidlertid blevet afdækket en række ikke-dødsfunktioner for nogle familiemedlemmer ^4,5. Meget af vores forståelse af caspase-funktion stammer fra arbejde i cellekultur og fra inferentielle data fra menneskelig sygdom. Mens det er værdsat, at der er afvigende induktion, aktivering eller inaktivering af caspaser i sygdom, har det væ…

Materials

anti-Caspase-7 488	Novus Biologicals	NB-56529AF488	use at 1:150
anti-cl-Caspase-9	Cell Signaling	9505-S	use at 1:800
anti-CD31	BD Pharmingen	553370	use at 1:50
Confocal Spinning Disc Microscope	Biovision
FIJI 2.3.0	open source
Fluormount G	Fisher	50-187-88
Forcep	Roboz	RS-5015
iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice	lab generated		see Avrutsky 2020
Isolectin (594, 649)	Vector	DL-1207	use at 1:200
Ketamine Hydrochloride	Henry Schein	NDC: 11695-0702-1
Perfusion pump	Masterflex
Pen1-XBir3	lab generated		see Avrutsky 2020
Prism 9.1	GraphPad
Tissue-Tek O.C.T.	Fisher	14-373-65
Vis-a-View 4.0	Visitron Systems
Xylazine	Akorn	NDCL 59399-110-20