Beoordeling van intestinale transcytose van neonatale Escherichia coli bacteriëmie-isolaten
Summary
Escherichia coli veroorzaakt sepsis bij pasgeborenen die de bacteriën rond het moment van geboorte binnenkrijgen. Het proces dat betrokken is bij het vermogen van E. coli om van het enterische kanaal naar de bloedbaan te reizen, is slecht begrepen. Dit in vitro model beoordeelt het vermogen van E. coli stammen om door de darmepitheelcellen te reizen.
Abstract
Pasgeborenen krijgen maternale E. coli-stammen binnen die hun darmkanaal koloniseren rond het moment van de bevalling. E. coli-stammen met het vermogen om over de darm te transloceren, dringen de bloedbaan van de pasgeborene binnen en veroorzaken levensbedreigende bacteriëmie. De hier gepresenteerde methodologie maakt gebruik van gepolariseerde intestinale epitheelcellen gekweekt op semipermeabele inserts om de transcytose van neonatale E. coli-bacteriëmie-isolaten in vitro te beoordelen. Deze methode maakt gebruik van de gevestigde T84 intestinale cellijn die het vermogen heeft om te groeien tot samenvloeiing en tight junctions en desmosomen te vormen. Na het bereiken van confluence ontwikkelen volwassen T84-monolagen transepitheliale weerstand (TEER), die kan worden gekwantificeerd met behulp van een voltmeter. De TEER-waarden zijn omgekeerd gecorreleerd met de paracellulaire permeabiliteit van extracellulaire componenten, waaronder bacteriën, in de intestinale monolaag. De transcellulaire passage van bacteriën (transcytose) daarentegen verandert niet noodzakelijkerwijs de TEER-metingen. In dit model wordt de bacteriële passage door de intestinale monolaag gekwantificeerd voor maximaal 6 uur na infectie en worden herhaalde metingen van TEER uitgevoerd om de paracellulaire permeabiliteit te controleren. Bovendien vergemakkelijkt deze methode het gebruik van technieken zoals immunostaining om de structurele veranderingen in tight junctions en andere cel-naar-cel adhesie-eiwitten tijdens bacteriële transcytose over het gepolariseerde epitheel te bestuderen. Het gebruik van dit model draagt bij aan de karakterisering van de mechanismen waarmee neonatale E. coli transcytose over het darmepitheel bacteriëmie produceert.
Introduction
Escherichia coli is de meest voorkomende oorzaak van sepsis met vroege aanvang bij pasgeborenen 1,2,3. Het sterftecijfer van neonatale E. coli-bacteriëmie kan 40% bereiken en meningitis is een mogelijke complicatie die gepaard gaat met ernstige neurologische ontwikkelingsstoornissen2. De inname van maternale E. coli-stammen door de pasgeborene kan neonatale bacteriëmie veroorzaken; dit proces is gerepliceerd in diermodellen 2,4. Eenmaal ingenomen, reizen pathogene bacteriën vanuit het neonatale darmlumen over de darmbarrière en komen in de bloedbaan terecht, waardoor bloedvergiftiging ontstaat. Neonatale invasieve E. coli-stammen die bacteriëmie produceren, variëren in hun vermogen om darmepitheelcellen binnen te dringen 1,5. Hun vermogen om het darmepitheel na een invasie te transcytose is echter niet volledig gekarakteriseerd.
Dit intestinale transcytosemodel is een nuttige in vitro methode om bacteriële passage over het darmepitheel na te bootsen. Het algemene doel van de methoden die in dit manuscript worden gepresenteerd, is om het vermogen van neonatale E. coli-isolaten te vergelijken met transcytose van het darmepitheel. Het hier beschreven model maakt gebruik van T84-cellen, die vereeuwigde menselijke intestinale adenocarcinoomcellen zijn 6,7. T84-cellen worden gekweekt tot samenvloeiing op een semipermeabel membraan met twee afzonderlijke compartimenten. De reden voor het gebruik van deze techniek is dat, zoals in vivo gebeurt, deze darmcellen polariseren en volwassen tight junctions ontwikkelen 6,8. De kant die in contact komt met het membraan wordt de basale kant. De andere kant van de cellen wordt de apicale kant, die lijkt op het darmlumen waar ingenomen pathogenen zich hechten en binnendringen. Het transwellmembraan is doorlaatbaar voor bacteriën, maar de gepolariseerde darmcellen vormen tight junctions, die bacteriële paracellulaire bewegingen aantasten9. Deze methode biedt dus het voordeel van een gecontroleerde in vitro omgeving met behulp van een menselijke cellijn om het proces van bacteriële transcytose te bestuderen, inclusief de transcellulaire route. Terwijl er andere methoden bestaan om de transcytose van bacteriën in het darmepitheel te onderzoeken, biedt de hier gepresenteerde transwell-methode meer gemak en toegankelijkheid. Alternatieve technieken, zoals die met behulp van ex vivo monsters die zijn opgezet in Ussing-kamersystemen, zijn beschikbaar. Ze gebruiken echter weefselspecimens die mogelijk niet gemakkelijk toegankelijk zijn, vooral als het onderzoek van plan is de menselijke fysiologie tebestuderen 10. Intestinale organoïden zijn een ander voorbeeld van een in vitro alternatief voor het bestuderen van gastheer-bacterie interacties11. Hoewel organoïde monolagen ook in het transwell-systeem kunnen worden gebruikt om bacteriële transcytose te bestuderen, vereisen ze de isolatie en groei van stamcellen en het gebruik van specifieke groeifactoren om differentiatie te induceren12. Het gebruik ervan is dus tijdrovender en gaat gepaard met hogere kosten in vergelijking met de transwell-methode die in dit manuscript wordt beschreven.
De beoordeling van bacteriële passage door het darmepitheel met behulp van dit in vitro transwell-systeem is met succes uitgevoerd voor verschillende pathogenen. Deze studies hebben het nut aangetoond van het transwell-systeem dat T84-cellen gebruikt om de transcytose van bacteriën over het gepolariseerde darmepitheel te karakteriseren 13,14,15. De toepassing van deze transwellmethode om het transcytosevermogen van bacteriëmieproducerende neonatale E. coli-stammen te vergelijken, is echter niet in detail beschreven. Dit manuscript biedt andere onderzoekers een standaard transwell-protocol dat betrouwbaar en gemakkelijk te gebruiken is en geen te dure middelen vereist.
Om het vermogen van neonatale invasieve E. coli-stammen om het darmepitheel te transcytose te vergelijken, kan de apicale kant van de intestinale epitheliale monolaag worden geïnfecteerd met een bekend aantal bacteriële cellen. Na incubatie kan het medium aan de basale kant van het epitheel worden verzameld en de bacteriën worden gekwantificeerd om de hoeveelheid bacteriële transcytose in de loop van de tijd te bepalen. In dit manuscript worden de gepresenteerde methoden gebruikt om het transcytosevermogen van neonatale E. coli klinische stammen te bestuderen die zijn hersteld van pasgeborenen die in het ziekenhuis zijn opgenomen met bacteriëmie. De inclusiecriteria voor de selectie van deze neonatale klinische isolaten voor transcytosestudies zijn eerder gepubliceerd 1,2,16. Wanneer deze methode wordt uitgevoerd met behulp van verschillende E. coli-stammen, kunnen hun transcytosecapaciteiten worden vergeleken. Door dit proces biedt het intestinale transcytosemodel waardevolle gegevens om de virulentiefactoren van E. coli te karakteriseren die bijdragen aan het meerstappenproces dat culmineert in de ontwikkeling van neonatale bacteriëmie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze methode is afgeleid van technieken die worden gebruikt in gastro-enterologie en infectieziekten20. In vitro modellen van de intestinale epitheliale barrière zijn gebruikt om de mechanismen op te helderen waarmee de luminale inhoud interageert met deze relevante component van aangeboren immuniteit 6,8. De gastheer-pathogeen interacties van invasieve neonatale E. coli zijn ook afzonderlijk gekarakteriseerd door geneti…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een Sarah Morrison-studiebeurs uitgegeven door de University of Missouri-Kansas City School of Medicine aan A.I.
Materials
| 10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 15 mL sterile conical tubes | MidSci | C15B | |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Avant | AVSS2000 | |
| 50 mL sterile polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Aspirator | Corning | 4930 | |
| Biosafety Cabinets | Labconco | 30441010028343 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work. |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Disposable inoculation loops | Fisherbrand | 22363605 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-084 | |
| Epithelial Volt/Ohm Meter | World Precision Instruments | EVOM | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Gibco | 11765-047 | |
| Hemacytometer | Sigma Aldrich, Bright Line | Z359629 | |
| Incubator shaker | New Brunswick | Innova 4080 | |
| Incubators | Thermo Scientific | 51030284 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation. |
| Lysogeny broth | Difco | 244610 | |
| Lysogeny broth agar | IBI Scientific | IB49101 | |
| Nikon Eclipse TS2R Microscope | Nikon | ||
| Spectrophotometer | Unico | 1100RS | |
| T84 Intestinal Cells | American Tissue Culture Collection | CCL248 | |
| Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores, 24 well format | Falcon | 353096 | |
| Tissue culture plate, 24 wells | Falcon | 353504 | |
| Trypan blue stain | Fisher Scientific | T10282 |
Referências
- Shakir, S. M., Goldbeck, J. M., Robison, D., Eckerd, A. M., Chavez-Bueno, S. Genotypic and phenotypic characterization of invasive neonatal Escherichia coli clinical isolates. American Journal of Perinatology. 31 (11), 975-982 (2014).
- Cole, B. K., et al. Route of infection alters virulence of neonatal septicemia Escherichia coli clinical isolates. PloS One. 12 (12), 0189032 (2017).
- Stoll, B. J., et al. Early-onset neonatal sepsis 2015 to 2017, the rise of Escherichia coli, and the need for novel prevention strategies. Journal of the American Medical Association Pediatrics. 174 (7), 200593 (2020).
- Dalgakiran, F., Witcomb, L. A., McCarthy, A. J., Birchenough, G. M., Taylor, P. W. Non-invasive model of neuropathogenic Escherichia coli infection in the neonatal rat. Journal of Visualized Experiments. (92), e52018 (2014).
- Williams, M., et al. Whole-genome sequencing-based phylogeny, antibiotic resistance, and invasive phenotype of Escherichia coli strains colonizing the cervix of women in preterm labor. BMC Microbiology. 21 (1), 330 (2021).
- Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Devriese, S., et al. T84 monolayers are superior to Caco-2 as a model system of colonocytes. Histochemistry and Cell Biology. 148 (1), 85-93 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), 029314 (2018).
- Awad, W. A., Hess, C., Hess, M. Enteric pathogens and their toxin-induced disruption of the intestinal barrier through alteration of tight junctions in chickens. Toxins. 9 (2), 60 (2017).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: A fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology – A review of methods. Experimental and Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
- Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiology Spectrum. 9 (1), 0000321 (2021).
- Gavin, H. E., Beubier, N. T., Satchell, K. J. The effector domain region of the Vibrio vulnificus MARTX toxin confers biphasic epithelial barrier disruption and is essential for systemic spread from the intestine. PLoS Pathogens. 13 (1), 1006119 (2017).
- Kobayashi, H., et al. Aeromonas sobria serine protease decreases epithelial barrier function in T84 cells and accelerates bacterial translocation across the T84 monolayer in vitro. PloS One. 14 (8), 0221344 (2019).
- Kalischuk, L. D., Inglis, G. D., Buret, A. G. Campylobacter jejuni induces transcellular translocation of commensal bacteria via lipid rafts. Gut Pathogens. 1 (1), 2 (2009).
- Cole, B. K., Ilikj, M., McCloskey, C. B., Chavez-Bueno, S. Antibiotic resistance and molecular characterization of bacteremia Escherichia coli isolates from newborns in the United States. PloS One. 14 (7), 0219352 (2019).
- Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
- den Hartog, G., et al. Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 restricts the internalization of bacteria into human intestinal epithelial cells through the inhibition of Rac1. Frontiers in Immunology. 11, 553994 (2020).
- Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
- Lievin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: Lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (3), 380-439 (2013).
- Kaczmarek, A., Budzynska, A., Gospodarek, E. Detection of K1 antigen of Escherichia coli rods isolated from pregnant women and neonates. Folia Microbiologica. 59 (5), 419-422 (2014).
- Kalita, A., Hu, J., Torres, A. G. Recent advances in adherence and invasion of pathogenic Escherichia coli. Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (5), 459-464 (2014).
- McCool, D. J., Marcon, M. A., Forstner, J. F., Forstner, G. G. The T84 human colonic adenocarcinoma cell line produces mucin in culture and releases it in response to various secretagogues. Biochemical Journal. 267 (2), 491-500 (1990).
- Resta-Lenert, S., Barrett, K. E. Enteroinvasive bacteria alter barrier and transport properties of human intestinal epithelium: Role of iNOS and COX-2. Gastroenterology. 122 (4), 1070-1087 (2002).
- Elatrech, I., et al. Escherichia coli LF82 differentially regulates ROS production and mucin expression in intestinal epithelial T84 cells: Implication of NOX1. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (5), 1018-1026 (2015).
- El-Aouar Filho, R. A., et al. Heterogeneous family of cyclomodulins: Smart weapons that allow bacteria to hijack the eukaryotic cell cycle and promote infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 208 (2017).
- Hopkins, A. M., Walsh, S. V., Verkade, P., Boquet, P., Nusrat, A. Constitutive activation of Rho proteins by CNF-1 influences tight junction structure and epithelial barrier function. Journal of Cell Science. 116, 725-742 (2003).
- Shiou, S. R., et al. Erythropoietin protects intestinal epithelial barrier function and lowers the incidence of experimental neonatal necrotizing enterocolitis. Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12123-12132 (2011).
- Newburg, D. S., Ko, J. S., Leone, S., Nanthakumar, N. N. Human milk oligosaccharides and synthetic galactosyloligosaccharides contain 3’-, 4-, and 6′-galactosyllactose and attenuate inflammation in human T84, NCM-460, and H4 cells and intestinal tissue ex vivo. Journal of Nutrition. 146 (2), 358-367 (2016).
- Burns, J. L., Griffith, A., Barry, J. J., Jonas, M., Chi, E. Y. Transcytosis of gastrointestinal epithelial cells by Escherichia coli K1. Pediatric Research. 49 (1), 30-37 (2001).
- Raut, B., Chen, L. J., Hori, T., Kaji, H. An open-source add-on EVOM((R)) device for real-time transepithelial/endothelial electrical resistance measurements in multiple transwell samples. Micromachines. 12 (3), 282 (2021).
- McCarthy, A. J., Stabler, R. A., Taylor, P. W. Genome-wide identification by transposon insertion sequencing of Escherichia coli K1 genes essential for in vitro growth, gastrointestinal colonizing capacity, and survival in serum. Journal of Bacteriology. 200 (7), 00698 (2018).
- Sayoc-Becerra, A., et al. The JAK-inhibitor tofacitinib rescues human intestinal epithelial cells and colonoids from cytokine-induced barrier dysfunction. Inflammatory Bowel Diseases. 26 (3), 407-422 (2020).
