Bedömning av tarmtranscytos av neonatala Escherichia coli bakterieemiisolat

Summary

Escherichia coli orsakar sepsis hos nyfödda som får i sig bakterierna runt födseln. Processen som är involverad i E. colis förmåga att resa från det enteriska området till blodomloppet är dåligt förstådd. Denna in vitro-modell bedömer förmågan hos E. coli-stammar att resa genom tarmepitelcellerna.

Abstract

Nyfödda intar moderns E. coli-stammar som koloniserar deras tarmkanal runt leveranstiden. E. coli-stammar med förmågan att translokera över tarmen invaderar den nyfödda blodomloppet och orsakar livshotande bakterieemi. Metoden som presenteras här använder polariserade tarmepitelceller som odlas på semipermeabla insatser för att bedöma transcytosen av neonatala E. coli-bakterieemiisolat in vitro. Denna metod använder den etablerade T84 tarmcellinjen som har förmågan att växa till sammanflöde och bilda täta korsningar och desmosomer. Efter att ha nått sammanflöde utvecklar mogna T84-monolager transepitelresistens (TEER), som kan kvantifieras med hjälp av en voltmeter. TEER-värdena är omvänt korrelerade med den paracellulära permeabiliteten hos extracellulära komponenter, inklusive bakterier, över tarmmonoskiktet. Den transcellulära passagen av bakterier (transcytos) förändrar å andra sidan inte nödvändigtvis TEER-mätningarna. I denna modell kvantifieras bakteriell passage över tarmmonolagret i upp till 6 timmar efter infektion, och upprepade mätningar av TEER görs för att övervaka den paracellulära permeabiliteten. Dessutom underlättar denna metod användningen av tekniker som immunfärgning för att studera strukturella förändringar i täta korsningar och andra cell-till-cell-vidhäftningsproteiner under bakteriell transcytos över det polariserade epitelet. Användningen av denna modell bidrar till karakteriseringen av de mekanismer genom vilka neonatal E. coli transcytos över tarmepitelet för att producera bakterieemi.

Introduction

Escherichia coli är den vanligaste orsaken till tidig sepsis hos nyfödda ^1,2,3. Dödligheten hos neonatal E. coli-bakteriemi kan nå 40%, och hjärnhinneinflammation är en möjlig komplikation som är förknippad med allvarliga neurodevelopmental funktionshinder². Intag av moderns E. coli-stammar av nyfödda kan producera neonatal bakterieemi; Denna process har replikerats i djurmodellerna ^2,4. När de väl har intagits reser patogena bakterier från neonatal tarmlumen över tarmbarriären och kommer in i blodomloppet och orsakar septikemi. Neonatala invasiva E. coli-stammar som producerar bakteriemi varierar i deras förmåga att invadera tarmepitelceller ^1,5. Men deras förmåga att transcytose tarmepitelet efter invasion har inte karakteriserats fullständigt.

Denna tarmtranscytosmodell är en användbar in vitro-metod för att emulera bakteriell passage över tarmepitelet. Det övergripande målet med de metoder som presenteras i detta manuskript är att jämföra förmågan hos neonatala E. coli-isolat att transcytosa tarmepitelet. Modellen som beskrivs här använder T84-celler, som är odödliga humana intestinala adenokarcinomceller ^6,7. T84-celler odlas till sammanflöde på ett semipermeabelt membran med två separata fack. Motiveringen för att använda denna teknik är att, som händer in vivo, dessa tarmceller polariserar och utvecklar mogna täta korsningar ^6,8. Sidan i kontakt med membranet blir basalsidan. Den motsatta sidan av cellerna blir den apikala sidan, som liknar tarmlumen där intagna patogener fäster och invaderar. Transwellmembranet är permeabelt för bakterier, men de polariserade tarmcellerna bildar täta korsningar, vilket försämrar bakteriell paracellulär rörelse⁹. Således ger denna metod fördelen med en kontrollerad in vitro-miljö som använder en mänsklig cellinje för att studera processen med bakteriell transcytos, inklusive den transcellulära vägen. Medan det finns andra metoder för att undersöka transcytos av bakterier över tarmepitelet, ger transwell-metoden som presenteras här större lätthet och tillgänglighet. Alternativa tekniker, såsom de som använder ex vivo-prover som ställts in i Ussing-kammarsystem, finns tillgängliga. De använder dock vävnadsprover som kanske inte är lättillgängliga, särskilt om forskningen avser att studera mänsklig fysiologi¹⁰. Tarmorganoider representerar ett annat exempel på ett in vitro-alternativ för att studera värd-bakterieinteraktioner¹¹. Medan organoidmonolager också kan användas i transwellsystemet för att studera bakteriell transcytos, kräver de isolering och tillväxt av stamceller och användning av specifika tillväxtfaktorer för att inducera differentiering¹². Således är deras användning mer tidskrävande och förknippad med större kostnader jämfört med transwellmetoden som beskrivs i detta manuskript.

Bedömningen av bakteriell passage över tarmepitelet med hjälp av detta de vitro-transwellsystem har framgångsrikt utförts för olika patogener. Dessa studier har visat nyttan av transwellsystemet som använder T84-celler för att karakterisera transcytos av bakterier över det polariserade tarmepitelet^13,14,15. Tillämpningen av denna transwellmetod för att jämföra transcytosförmågan hos bakteriemimi producerande neonatala E. coli-stammar har emellertid inte beskrivits i detalj. Detta manuskript ger andra forskare ett standard transwell-protokoll som är pålitligt och enkelt att använda och inte kräver resurser som är för dyra.

För att jämföra förmågan hos neonatala invasiva E. coli-stammar att transcytosa tarmepitelet kan den apikala sidan av tarmepitelmonolagret infekteras med ett känt antal bakterieceller. Efter inkubation kan mediet på epitelets basala sida samlas in och bakterierna kvantifieras för att bestämma mängden bakteriell transcytos över tiden. I detta manuskript används de presenterade metoderna för att studera transcytosförmågan hos neonatala E. coli kliniska stammar som återhämtats från nyfödda på sjukhus med bakterieemi. Inklusionskriterierna för urval av dessa neonatala kliniska isolat för transcytosstudier har tidigare publicerats ^1,2,16. När denna metod utförs med olika E. coli-stammar kan deras transcytosförmåga jämföras. Genom denna process ger tarmtranscytosmodellen värdefulla data för att karakterisera virulensfaktorerna för E. coli som bidrar till flerstegsprocessen som kulminerar i utvecklingen av neonatal bakterieemi.

Protocol

OBS: Utför alla manipuleringar av T84-celler, bakterier, plattor och reagenser i ett säkerhetsskåp för biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) för att undvika kontaminering. Använd separata områden och inkubatorer för allt arbete som involverar sterila T84-celler, infekterade T84-celler och E. coli. De kliniska E. coli-isolat som testats med de metoder som beskrivs här erhölls enligt riktlinjerna från Institutional Review Board vid vår institution 1,16.<sup class="xre…

Representative Results

Figur 1: T84 TEER över tid. När T84-cellskiktet mognar på insatsen ökar monoskiktets elektriska motstånd. Vid en TEER på minst 1 000 Ω·cm2 är cellskiktet tillräckligt utvecklat för att minska den paracellulära bakterietransporten och möjliggöra mätning av främst transcellulär bakterietransitering. Felstaplarna anger stand…

Discussion

Denna metod härrör från tekniker som används i gastroenterologi och infektionssjukdom²⁰. In vitro-modeller av tarmepitelbarriären har använts för att belysa de mekanismer genom vilka luminalinnehållet interagerar med denna relevanta komponent av medfödd immunitet ^6,8. Värd-patogeninteraktionerna för invasiv neonatal E. coli har också karakteriserats separat genom genetisk analys, studier av antimikrobiell resi…

Materials

10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture	Fisher Scientific	15-140-122
15 mL sterile conical tubes	MidSci	C15B
2 mL microcentrifuge tubes	Avant	AVSS2000
50 mL sterile polypropylene conical tubes	Falcon	352070
Aspirator	Corning	4930
Biosafety Cabinets	Labconco	30441010028343	Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work.
Centrifuge	Sorvall	Legend RT
Disposable inoculation loops	Fisherbrand	22363605
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-084
Epithelial Volt/Ohm Meter	World Precision Instruments	EVOM
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	10437028
Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11765-047
Hemacytometer	Sigma Aldrich, Bright Line	Z359629
Incubator shaker	New Brunswick	Innova 4080
Incubators	Thermo Scientific	51030284	Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation.
Lysogeny broth	Difco	244610
Lysogeny broth agar	IBI Scientific	IB49101
Nikon Eclipse TS2R Microscope	Nikon
Spectrophotometer	Unico	1100RS
T84 Intestinal Cells	American Tissue Culture Collection	CCL248
Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores,  24 well format	Falcon	353096
Tissue culture plate, 24 wells	Falcon	353504
Trypan blue stain	Fisher Scientific	T10282