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Bioquímica

Difusão e Montagem de Molécula Única em Membranas Lipídicas Repletas de Polímeros

Published: July 19, 2022
doi:
10.3791/64243
, , , , ,
1Department of Chemical Engineering,Indian Institute of Science, 2Holonyak Micro & Nanotechnology Lab,University of Illinois, Urbana-Champaign, 3Center for BioSystems Science and Engineering,Indian Institute of Science

Summary

Aqui, um protocolo para realizar e analisar a ligação, mobilidade e montagem de moléculas individuais em membranas lipídicas artificiais apinhadas usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total de molécula única (smTIRF) é apresentado.

Abstract

As membranas celulares são ambientes altamente lotados para reações biomoleculares e sinalização. No entanto, a maioria dos experimentos in vitro que investigam a interação de proteínas com lipídios emprega membranas bicamadas nuas. Tais sistemas carecem das complexidades do apinhamento por proteínas e glicanos embutidos na membrana e excluem os efeitos de volume associados encontrados nas superfícies da membrana celular. Além disso, a superfície de vidro carregada negativamente na qual as bicamadas lipídicas são formadas impede a difusão livre de biomoléculas transmembranares. Aqui, apresentamos uma membrana polimérico-lipídica bem caracterizada como uma mímica para membranas lipídicas lotadas. Este protocolo utiliza lipídios conjugados com polietilenoglicol (PEG) como uma abordagem generalizada para incorporar crowders na bicamada lipídica suportada (SLB). Primeiro, um procedimento de limpeza das lâminas microscópicas e coverslips para a realização de experimentos de molécula única é apresentado. Em seguida, são discutidos métodos para caracterizar os PEG-SLBs e realizar experimentos de molécula única de ligação, difusão e montagem de biomoléculas usando rastreamento de molécula única e fotobranqueamento. Finalmente, este protocolo demonstra como monitorar a montagem de nanoporos da toxina formadora de poros bacterianos Citolisina A (ClyA) em membranas lipídicas lotadas com análise de fotobranqueamento de molécula única. Os códigos MATLAB com conjuntos de dados de exemplo também são incluídos para executar algumas das análises comuns, como rastreamento de partículas, extração de comportamento difusivo e contagem de subunidades.

Introduction

As membranas celulares são sistemas altamente lotados e complexos1. O apinhamento molecular pode ter um impacto considerável na difusão de entidades ligadas à membrana, como proteínas e lipídios 2,3,4. Da mesma forma, reações bimoleculares em membranas lipídicas como a dimerização de receptores ou a oligomerização de complexos de membranas são influenciadas pelo apinhamento 5,6,7. A natureza, a configuração e a concentração de crowders podem governar a ligação da membrana, a difusividade e a interação proteína-proteína de várias maneiras 8,9. Como controlar o aglomeramento de membranas nas membranas celulares e interpretar sua influência sobre as biomoléculas embutidas é um desafio, os pesquisadores têm tentado estabelecer sistemas in vitro alternativos10.

Uma abordagem popular para membranas artificiais apinhadas é a dopagem das membranas bicamadas com lipídios enxertados com polímero (como polietilenoglicol, PEG)11,12. Durante a visualização da dinâmica de proteínas e lipídios em bicamadas lipídicas suportadas (SLBs), esses polímeros adicionalmente protegem os componentes embutidos na membrana do substrato subjacente carregado negativamente (como o vidro), levantando efetivamente a bicamada para longe do suporte subjacente. Variando o tamanho e a concentração do polímero, pode-se controlar a extensão do apinhamento molecular, bem como sua separação do suporte sólido subjacente13,14. Esta é claramente uma vantagem sobre as bicamadas lipídicas suportadas em substratos sólidos sem almofadas poliméricas15,16, onde as biomoléculas transmembranares podem perder sua atividade17,18,19. Mais importante, nos permite recapitular o ambiente lotado da membrana celular in vitro, o que é crítico para muitos processos de membrana.

Polímeros enxertados superficialmente em membranas também sofrem alterações em sua configuração dependendo de sua densidade de enxerto12. Em baixas concentrações, eles permanecem em uma configuração entropicalmente enrolada, conhecida como cogumelo, acima da superfície da membrana. Com o aumento da concentração, eles começam a interagir e tendem a se desenrolar e se estender, finalmente produzindo uma densa formação em forma de escova na membrana21. Uma vez que a transição do cogumelo para o regime de escova é altamente heterogênea e se manifesta em condições mal caracterizadas do polímero, é importante usar condições bem caracterizadas para apinhamento em membranas enxertadas com polímero. Em comparação com um estudo recente20, identificamos e relatamos composições de membranas lotadas que mantêm o transporte difusivo e a atividade das biomoléculas transmembranares.

Neste protocolo, discutimos como gerar membranas lipídicas PEGiladas e fornecemos recomendações para densidades de PEG que imitam o apinhamento em dois regimes diferentes de configuração polimérica (a saber, cogumelo e escova). O protocolo também descreve a ligação de molécula única, o rastreamento de partículas e a aquisição e análise de dados de fotobranqueamento para moléculas embutidas nessas membranas lotadas. Primeiro, descrevemos as etapas de limpeza completas, a montagem da câmara de imagem e a geração de PEG-SLBs. Em segundo lugar, fornecemos detalhes para os experimentos de ligação de molécula única, rastreamento de partículas e fotobranqueamento. Em terceiro lugar, discutimos i) extrair as afinidades relativas de ligação, ii) caracterizar a difusão molecular e iii) contar subunidades em um conjunto de proteínas a partir de filmes de moléculas individuais na membrana.

Embora tenhamos caracterizado esse sistema com imagens de molécula única, o protocolo é útil para todos os biofísicos de membrana interessados em entender o efeito do aglomeração em reações biomoleculares em membranas lipídicas. No geral, apresentamos um pipeline robusto para a fabricação de bicamadas lipídicas lotadas e suportadas, juntamente com vários ensaios de molécula única realizados sobre eles e as rotinas de análise correspondentes.

Protocol

1. Limpeza da lâmina e da tampa para experimentos de molécula única Antes da montagem da câmara de imagem, limpe e prepare as folhas de cobertura e as corrediças. Faça vários pares de furos nas lâminas de vidro usando uma máquina de perfuração com brocas revestidas de diamante (0,5-1 mm de diâmetro). Se forem usadas chapas de acrílico, use um cortador a laser para fazer furos precisos (0,5 mm), como mostra a Figura 1.NOTA: Cada par de orifícios at…

Representative Results

Monitorização da ligação da proteína ClyA nas membranas PEGiladasApós a etapa 4.5, a cinética de ligação é estimada plotando o número de partículas que se ligam à superfície da membrana ao longo do tempo (Vídeo 1). À medida que a proteína ClyA se liga a uma membrana com 5 mol% de lipídios PEG2000, a densidade de partículas aumenta e atinge a saturação (Figura 5). Um ajuste de decaimento exponencial às partículas ligadas (círculos …

Discussion

Aqui, demonstramos experimentos de molécula única em bicamadas lipídicas suportadas (SLBs) que manifestam um ambiente lotado para biomoléculas embutidas em membrana. O ambiente lotado gera um efeito de volume excluído, levando ao aumento das reações biomoleculares 1,2,39,40. Para o sistema lipídico PEG, onde o polímero ocupa principalmente o volume fora da bicamada, esse efeito é espe…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores reconhecem o Prof. Benjamin Schuler por compartilhar a expressão plasmídeo para a proteína ClyA. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Ciência de Fronteira Humana (RGP0047-2020).

Materials

2.5 ml Syringes HMD Healthcare Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin Plastic syringe
Acetone Finar Chemicals 10020LL025
Acrylic Sheet 2 mm thick
Acrylic Sheet BigiMall 2 mm, Clear
Bath Sonicator Branson CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform Sigma 528730  HPLC grade
Cholesterol Avanti 700100
Coplin Jar Duran Wheaton Kimble S6016 8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips VWR 631-1574 24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand IDT GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3) Cytiva Life Sciences PA23001
DiI Invitrogen D3911 Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1 Sigma Aldrich GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
DNA Connector Strand 2 Sigma Aldrich CGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand Biomers Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000 Avanti 880130 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape 3M LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated) 0.5 – 1 mm
Drilling Machine Dremel 220 Workstation
EMCCD Andor DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads Invitrogen F10720
Glass Slides Blue Star Micro Slides, PIC-1
Glass Vials Sigma 854190
Hydrogen Peroxide Lobachemie 00182 30% Solution, AR Grade
Labolene Thermo-Fischer Scientific  Detergent
Laser 532 nm Coherent Sapphire
Laser Cutter Universal Laser Systems ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE Avanti 810150 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol Finar Chemicals 30932LL025
Microscope Olympus IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1X
Plasma Cleaner Harrick Plasma Inc PDC-002
POPC Avanti 850457 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE1010 High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps Sigma 27141
PTFE Tubing Cole-Parmer WW-06417-21 Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid SD Fine Chemicals 98%, AR Grade
TIRF Objective Olympus UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator Tarsons
Vortex Mixer Tarsons
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Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., Umrao, S., Parwana, D., Roy, R. Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (185), e64243, doi:10.3791/64243 (2022).
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