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Bioquímica

Diffusion et assemblage d’une molécule unique sur des membranes lipidiques encombrées de polymères

Published: July 19, 2022
doi:
10.3791/64243
, , , , ,
1Department of Chemical Engineering,Indian Institute of Science, 2Holonyak Micro & Nanotechnology Lab,University of Illinois, Urbana-Champaign, 3Center for BioSystems Science and Engineering,Indian Institute of Science

Summary

Ici, un protocole pour effectuer et analyser la liaison, la mobilité et l’assemblage de molécules uniques sur des membranes lipidiques artificielles encombrées à l’aide de la microscopie à fluorescence interne totale à molécule unique (smTIRF) est présenté.

Abstract

Les membranes cellulaires sont des environnements très encombrés pour les réactions biomoléculaires et la signalisation. Pourtant, la plupart des expériences in vitro sondant l’interaction des protéines avec les lipides utilisent des membranes bicouches nues. De tels systèmes n’ont pas les complexités de l’encombrement par les protéines et les glycanes intégrés dans la membrane et excluent les effets de volume associés rencontrés sur les surfaces de la membrane cellulaire. En outre, la surface de verre chargée négativement sur laquelle les bicouches lipidiques sont formées empêche la libre diffusion des biomolécules transmembranaires. Ici, nous présentons une membrane polymère-lipide bien caractérisée comme imitateur pour les membranes lipidiques encombrées. Ce protocole utilise des lipides conjugués au polyéthylène glycol (PEG) comme approche généralisée pour incorporer des encombrements dans la bicouche lipidique supportée (SLB). Tout d’abord, une procédure de nettoyage des lames microscopiques et des lamelles de recouvrement pour effectuer des expériences sur une seule molécule est présentée. Ensuite, les méthodes de caractérisation des PEG-SLB et la réalisation d’expériences sur une seule molécule de liaison, de diffusion et d’assemblage de biomolécules à l’aide du suivi d’une seule molécule et du photoblanchiment sont discutées. Enfin, ce protocole montre comment surveiller l’assemblage nanoporeux de la toxine bactérienne formant des pores Cytolysine A (ClyA) sur des membranes lipidiques encombrées avec une analyse de photoblanchiment à molécule unique. Les codes MATLAB avec des exemples de jeux de données sont également inclus pour effectuer certaines des analyses courantes telles que le suivi des particules, l’extraction du comportement diffusif et le comptage des sous-unités.

Introduction

Les membranes cellulaires sont des systèmes complexes et très encombrés1. L’encombrement moléculaire peut avoir un impact considérable sur la diffusion d’entités liées à la membrane comme les protéines et les lipides 2,3,4. De même, les réactions bimoléculaires sur les membranes lipidiques comme la dimérisation des récepteurs ou l’oligomérisation des complexes membranaires sont influencées par l’encombrement 5,6,7. La nature, la configuration et la concentration des crowders peuvent régir la liaison membranaire, la diffusivité et l’interaction protéine-protéine de plusieurs façons 8,9. Étant donné qu’il est difficile de contrôler l’encombrement des membranes cellulaires et d’interpréter son influence sur les biomolécules intégrées, les chercheurs ont tenté d’établir d’autres systèmes in vitro 10.

Une approche populaire pour les membranes artificielles encombrées consiste à doper les membranes bicouches avec des lipides greffés de polymère (tels que le polyéthylène glycol, PEG)11,12. Au cours de la visualisation de la dynamique des protéines et des lipides sur les bicouches lipidiques soutenues (SLB), ces polymères protègent en outre les composants intégrés à la membrane du substrat sous-jacent chargé négativement (tel que le verre) en soulevant efficacement la bicouche loin du support sous-jacent. En faisant varier la taille et la concentration du polymère, on peut contrôler l’étendue de l’encombrement moléculaire, ainsi que sa séparation du support solide sous-jacent13,14. C’est clairement un avantage par rapport aux bicouches lipidiques supportées sur des substrats solides sans coussins polymères15,16, où les biomolécules transmembranaires peuvent perdre leur activité17,18,19. Plus important encore, cela nous permet de récapituler l’environnement encombré de la membrane cellulaire in vitro, ce qui est essentiel pour de nombreux processus membranaires.

Les polymères greffés en surface sur membranes subissent également des modifications de leur configuration en fonction de leur densité de greffage12. À de faibles concentrations, ils restent dans une configuration enroulée enroulée, connue sous le nom de champignon, au-dessus de la surface de la membrane. Avec l’augmentation de la concentration, ils commencent à interagir et ont tendance à se dérouler et à s’étendre, donnant finalement une formation dense en forme de brosse sur la membrane21. Étant donné que la transition du champignon au régime en brosse est très hétérogène et se manifeste dans des conditions mal caractérisées du polymère, il est important d’utiliser des conditions bien caractérisées pour l’encombrement sur les membranes greffées en polymère. Par rapport à une étude récente20, nous identifions et rapportons des compositions membranaires encombrées qui maintiennent le transport diffusif et l’activité des biomolécules transmembranaires.

Dans ce protocole, nous discutons de la façon de générer des membranes lipidiques PEGylées et fournissons des recommandations pour les densités de PEG qui imitent l’encombrement dans deux régimes différents de configuration de polymère (à savoir, champignon et brosse). Le protocole décrit également la liaison à une seule molécule, le suivi des particules et l’acquisition et l’analyse de données de photoblanchiment pour les molécules intégrées dans ces membranes encombrées. Tout d’abord, nous décrivons les étapes de nettoyage en profondeur, l’assemblage de la chambre d’imagerie et la génération de PEG-SLB. Deuxièmement, nous fournissons des détails pour les expériences de liaison à une seule molécule, de suivi des particules et de photoblanchiment. Troisièmement, nous discutons i) de l’extraction des affinités de liaison relatives, ii) de la caractérisation de la diffusion moléculaire et iii) du comptage des sous-unités dans un assemblage protéique à partir de films de molécules uniques sur la membrane.

Bien que nous ayons caractérisé ce système avec l’imagerie à molécule unique, le protocole est utile pour tous les biophysiciens membranaires intéressés à comprendre l’effet de l’encombrement sur les réactions biomoléculaires sur les membranes lipidiques. Dans l’ensemble, nous présentons un pipeline robuste pour la fabrication de bicouches lipidiques encombrées et soutenues, ainsi que divers tests à molécule unique menés sur eux et les routines d’analyse correspondantes.

Protocol

1. Nettoyage de la lame et de la lamelle de couverture pour les expériences sur une seule molécule Avant l’assemblage de la chambre d’imagerie, nettoyez et préparez les lames de couverture et les lames. Percez plusieurs paires de trous sur les lames de verre à l’aide d’une perceuse avec des forets revêtus de diamant (0,5 à 1 mm de diamètre). Si des feuilles d’acrylique sont utilisées, utilisez une découpeuse laser pour faire des trous précis (0,5 mm), comme illustré à la <…

Representative Results

Surveillance de la liaison de la protéine ClyA sur les membranes PEGyléesAprès l’étape 4.5, la cinétique de liaison est estimée en traçant le nombre de particules se liant à la surface de la membrane au fil du temps (vidéo 1). Lorsque la protéine ClyA se lie à une membrane contenant 5 mol% de lipides PEG2000, la densité des particules augmente et atteint la saturation (Figure 5). Une décroissance exponentielle adaptée aux particules liée…

Discussion

Ici, nous démontrons des expériences sur une seule molécule sur des bicouches lipidiques soutenues (SLB) qui manifestent un environnement encombré pour les biomolécules intégrées dans la membrane. L’environnement surpeuplé génère un effet de volume exclu, conduisant à l’amélioration des réactions biomoléculaires 1,2,39,40. Pour le système PEG-lipide, où le polymère occupe p…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient le professeur Benjamin Schuler pour avoir partagé le plasmide d’expression de la protéine ClyA. Ce travail a été soutenu par Human Frontier Science Program (RGP0047-2020).

Materials

2.5 ml Syringes HMD Healthcare Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin Plastic syringe
Acetone Finar Chemicals 10020LL025
Acrylic Sheet 2 mm thick
Acrylic Sheet BigiMall 2 mm, Clear
Bath Sonicator Branson CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform Sigma 528730  HPLC grade
Cholesterol Avanti 700100
Coplin Jar Duran Wheaton Kimble S6016 8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips VWR 631-1574 24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand IDT GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3) Cytiva Life Sciences PA23001
DiI Invitrogen D3911 Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1 Sigma Aldrich GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
DNA Connector Strand 2 Sigma Aldrich CGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand Biomers Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000 Avanti 880130 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape 3M LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated) 0.5 – 1 mm
Drilling Machine Dremel 220 Workstation
EMCCD Andor DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads Invitrogen F10720
Glass Slides Blue Star Micro Slides, PIC-1
Glass Vials Sigma 854190
Hydrogen Peroxide Lobachemie 00182 30% Solution, AR Grade
Labolene Thermo-Fischer Scientific  Detergent
Laser 532 nm Coherent Sapphire
Laser Cutter Universal Laser Systems ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE Avanti 810150 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol Finar Chemicals 30932LL025
Microscope Olympus IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1X
Plasma Cleaner Harrick Plasma Inc PDC-002
POPC Avanti 850457 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE1010 High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps Sigma 27141
PTFE Tubing Cole-Parmer WW-06417-21 Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid SD Fine Chemicals 98%, AR Grade
TIRF Objective Olympus UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator Tarsons
Vortex Mixer Tarsons
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Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., Umrao, S., Parwana, D., Roy, R. Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (185), e64243, doi:10.3791/64243 (2022).
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