Einzelmoleküldiffusion und Assemblierung auf polymerüberfüllten Lipidmembranen

Summary

Hier wird ein Protokoll zur Durchführung und Analyse der Bindung, Mobilität und Assemblierung einzelner Moleküle auf künstlichen überfüllten Lipidmembranen unter Verwendung der Einzelmolekül-Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (smTIRF) vorgestellt.

Abstract

Zellmembranen sind sehr überfüllte Umgebungen für biomolekulare Reaktionen und Signalübertragungen. Die meisten In-vitro-Experimente , die die Proteininteraktion mit Lipiden untersuchen, verwenden jedoch nackte Doppelschichtmembranen. Solche Systeme haben nicht die Komplexität der Verdrängung durch membraneingebettete Proteine und Glykane und schließen die damit verbundenen Volumeneffekte aus, die auf zellulären Membranoberflächen auftreten. Auch die negativ geladene Glasoberfläche, auf der die Lipiddoppelschichten gebildet werden, verhindert die freie Diffusion von Transmembran-Biomolekülen. Hier präsentieren wir eine gut charakterisierte Polymer-Lipid-Membran als Nachahmung für überfüllte Lipidmembranen. Dieses Protokoll verwendet Polyethylenglykol (PEG)-konjugierte Lipide als generalisierten Ansatz für den Einbau von Crowdern in die unterstützte Lipiddoppelschicht (SLB). Zunächst wird ein Reinigungsverfahren der mikroskopischen Objektträger und Deckgläser zur Durchführung von Einzelmolekülexperimenten vorgestellt. Als nächstes werden Methoden zur Charakterisierung der PEG-SLBs und zur Durchführung von Einzelmolekülexperimenten der Bindung, Diffusion und Assemblierung von Biomolekülen mittels Einzelmolekül-Tracking und Photobleaching diskutiert. Schließlich zeigt dieses Protokoll, wie die Nanoporenanordnung des bakteriellen porenbildenden Toxins Cytolysin A (ClyA) auf überfüllten Lipidmembranen mit Einzelmolekül-Photobleichanalyse überwacht werden kann. MATLAB-Codes mit Beispieldatensätzen sind ebenfalls enthalten, um einige der gängigen Analysen wie Partikelverfolgung, Extraktion von Diffusionsverhalten und Untereinheitenzählung durchzuführen.

Introduction

Zellmembranen sind sehr überfüllte und komplexe Systeme¹. Molekulares Crowding kann einen erheblichen Einfluss auf die Diffusion membrangebundener Entitäten wie Protein und Lipide ^2,3,4 haben. Ebenso werden bimolekulare Reaktionen auf Lipidmembranen wie die Rezeptordimerisierung oder die Oligomerisierung von Membrankomplexen durch Crowding ^5,6,7 beeinflusst. Die Art, Konfiguration und Konzentration von Crowdern kann die Membranbindung, Diffusivität und Protein-Protein-Interaktion auf verschiedene Weise steuern ^8,9. Da die Kontrolle der Membranüberfüllung auf zellulären Membranen und die Interpretation ihres Einflusses auf eingebettete Biomoleküle eine Herausforderung darstellt, haben Forscher versucht, alternative In-vitro-Systeme zu etablieren¹⁰.

Ein beliebter Ansatz für künstliche überfüllte Membranen ist die Dotierung der Doppelschichtmembranen mit polymeren (wie Polyethylenglykol, PEG)-gepfropften Lipiden^11,12. Während der Visualisierung der Protein- und Lipiddynamik auf unterstützten Lipiddoppelschichten (SLBs) schirmen diese Polymere die in die Membran eingebetteten Komponenten zusätzlich vom darunter liegenden negativ geladenen Substrat (z. B. Glas) ab, indem sie die Doppelschicht effektiv von der darunterliegenden Unterstützung wegheben. Durch Variation der Größe und Konzentration des Polymers kann man das Ausmaß der molekularen Verdrängung sowie seine Trennung vom zugrunde liegenden festen Träger^13,14 kontrollieren. Dies ist eindeutig ein Vorteil gegenüber Lipiddoppelschichten, die auf festen Substraten ohne Polymerpolster^15,16 gelagert werden, wo Transmembranbiomoleküle ihre Aktivität verlieren können^17,18,19. Noch wichtiger ist, dass es uns ermöglicht, die überfüllte Umgebung der Zellmembran in vitro zu rekapitulieren, was für viele Membranprozesse entscheidend ist.

Oberflächengepfropfte Polymere auf Membranen unterliegen ebenfalls Änderungen in ihrer Konfiguration in Abhängigkeit von ihrer Pfropfdichte¹². Bei geringen Konzentrationen verbleiben sie in einer entropisch gewundenen Konfiguration, einem sogenannten Pilz, über der Membranoberfläche. Mit zunehmender Konzentration beginnen sie zu interagieren und neigen dazu, sich abzuwickeln und auszudehnen, was schließlich zu einer dichten bürstenartigen Formation auf der Membran²¹ führt. Da der Übergang vom Pilz- zum Bürstenregime sehr heterogen ist und sich in schlecht charakterisierten Bedingungen des Polymers manifestiert, ist es wichtig, gut charakterisierte Bedingungen für das Gedränge auf polymergepfropften Membranen zu verwenden. Im Vergleich zu einer aktuellen Studie²⁰ identifizieren und berichten wir überfüllte Membranzusammensetzungen, die den diffusiven Transport und die Aktivität von Transmembranbiomolekülen aufrechterhalten.

In diesem Protokoll diskutieren wir, wie PEGylierte Lipidmembranen erzeugt werden können, und geben Empfehlungen für PEG-Dichten, die Crowding in zwei verschiedenen Regimen der Polymerkonfiguration (nämlich Pilz und Bürste) nachahmen. Das Protokoll beschreibt auch die Einzelmolekülbindung, Partikelverfolgung und Photobleichdatenerfassung und -analyse für Moleküle, die in diese überfüllten Membranen eingebettet sind. Zunächst beschreiben wir die gründlichen Reinigungsschritte, den Aufbau der Bildgebungskammer und die Erzeugung von PEG-SLBs. Zweitens liefern wir Details für die Einzelmolekülbindung, Partikelverfolgung und Photobleichexperimente. Drittens diskutieren wir i) die Extraktion der relativen Bindungsaffinitäten, ii) die Charakterisierung der molekularen Diffusion und iii) das Zählen von Untereinheiten in einer Proteinanordnung aus Filmen einzelner Moleküle auf der Membran.

Während wir dieses System mit Einzelmolekül-Bildgebung charakterisiert haben, ist das Protokoll für alle Membranbiophysiker nützlich, die daran interessiert sind, die Wirkung von Crowding auf biomolekulare Reaktionen auf Lipidmembranen zu verstehen. Insgesamt präsentieren wir eine robuste Pipeline zur Herstellung von überfüllten und unterstützten Lipiddoppelschichten, zusammen mit verschiedenen Einzelmolekül-Assays, die an ihnen durchgeführt werden, und den entsprechenden Analyseroutinen.

Protocol

1. Reinigung von Objektträger und Deckglas für Einzelmolekülexperimente Vor dem Zusammenbau der Bildkammer reinigen und bereiten Sie sowohl die Deckgläser als auch die Objektträger vor. Bohren Sie mehrere Lochpaare auf die Glasobjektträger mit einer Bohrmaschine mit diamantbeschichteten Bohrern (0,5-1 mm Durchmesser). Wenn Acrylplatten verwendet werden, verwenden Sie einen Laserschneider, um präzise Löcher (0,5 mm) zu bohren, wie in Abbildung 1 dargestellt….

Representative Results

Überwachung der Bindung von ClyA-Protein an PEGylierte MembranenNach Schritt 4.5 wird die Bindungskinetik geschätzt, indem die Anzahl der Partikel, die sich im Laufe der Zeit an die Membranoberfläche binden, aufgetragen wird (Video 1). Wenn das ClyA-Protein an eine Membran mit 5 Mol-% PEG2000-Lipiden bindet, nimmt die Partikeldichte zu und erreicht die Sättigung (Abbildung 5). Eine exponentielle Zerfallsanpassung an die gebundenen Teilchen (Cyankreis…

Discussion

Hier demonstrieren wir Einzelmolekülexperimente an unterstützten Lipiddoppelschichten (SLBs), die eine überfüllte Umgebung für membraneingebettete Biomoleküle manifestieren. Die überfüllte Umgebung erzeugt einen ausgeschlossenen Volumeneffekt, der zur Verstärkung biomolekularer Reaktionen führt 1,2,39,40. Für das PEG-Lipidsystem, bei dem das Polymer primär das Volumen außerhalb der…

Materials

2.5 ml Syringes	HMD Healthcare	Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin	Plastic syringe
Acetone	Finar Chemicals	10020LL025
Acrylic Sheet			2 mm thick
Acrylic Sheet	BigiMall		2 mm, Clear
Bath Sonicator	Branson	CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform	Sigma	528730	HPLC grade
Cholesterol	Avanti	700100
Coplin Jar	Duran Wheaton Kimble	S6016	8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips	VWR	631-1574	24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand	IDT		GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3)	Cytiva Life Sciences	PA23001
DiI	Invitrogen	D3911	Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1	Sigma Aldrich		GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC T
DNA Connector Strand 2	Sigma Aldrich		CGGACGCAATAGCAGCTCACAG TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand	Biomers		Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000	Avanti	880130	1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape	3M	LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated)			0.5 – 1 mm
Drilling Machine	Dremel	220	Workstation
EMCCD	Andor	DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads	Invitrogen	F10720
Glass Slides	Blue Star		Micro Slides, PIC-1
Glass Vials	Sigma	854190
Hydrogen Peroxide	Lobachemie	00182	30% Solution, AR Grade
Labolene	Thermo-Fischer Scientific		Detergent
Laser 532 nm	Coherent	Sapphire
Laser Cutter	Universal Laser Systems	ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE	Avanti	810150	1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol	Finar Chemicals	30932LL025
Microscope	Olympus	IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS)			1X
Plasma Cleaner	Harrick Plasma Inc	PDC-002
POPC	Avanti	850457	1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump	New Era Pump Systems	NE1010	High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps	Sigma	27141
PTFE Tubing	Cole-Parmer	WW-06417-21	Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid	SD Fine Chemicals		98%, AR Grade
TIRF Objective	Olympus	UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator	Tarsons
Vortex Mixer	Tarsons