Primär odling av svin retinala pigmentepitelceller
Summary
Här presenteras en lätt att följa metod för att odla primära svinretinala pigmentepitelceller in vitro .
Abstract
Retinal pigmentepitel (RPE) är ett monolager av polariserade pigmenterade epitelceller, belägna mellan choroid och neuroretina i näthinnan. Flera funktioner, inklusive fagocytos, närings- / metabolittransport, vitamin A-metabolism, etc., utförs av RPE dagligen. RPE-celler är terminalt differentierade epitelceller med liten eller ingen regenerativ kapacitet. Förlust av RPE-celler resulterar i flera ögonsjukdomar som leder till synnedsättning, såsom åldersrelaterad makuladegeneration. Därför är upprättandet av en in vitro-odlingsmodell av primära RPE-celler, som mer liknar RPE in vivo än cellinjer, avgörande för de karakteristiska och mekanistiska studierna av RPE-celler. Med tanke på att källan till mänskliga ögonbollar är begränsad skapar vi ett protokoll för att odla primära RPE-celler från svin. Genom att använda detta protokoll kan RPE-celler enkelt dissocieras från vuxna ögonbollar från svin. Därefter fäster dessa dissocierade celler till odlingsskålar / insatser, sprider sig för att bilda ett sammanflytande monolager och återupprättar snabbt viktiga egenskaper hos epitelvävnad in vivo inom 2 wks. Genom qRT-PCR visas det att primära RPE-celler hos svin uttrycker flera signaturgener på jämförbara nivåer med inbyggd RPE-vävnad, medan uttrycken för de flesta av dessa gener förloras/reduceras kraftigt i humana RPE-liknande celler, ARPE-19. Dessutom visar immunofluorescensfärgningen fördelningen av tät korsning, vävnadspolaritet och cytoskelettproteiner, liksom närvaron av RPE65, ett isomeras som är kritiskt för vitamin A-metabolism, i odlade primära celler. Sammantaget har vi utvecklat en lätt att följa metod för att odla primära RPE-celler hos svin med hög renhet och inbyggda RPE-funktioner, vilket kan fungera som en bra modell för att förstå RPE-fysiologi, studera celltoxiciteter och underlätta läkemedelsundersökningar.
Introduction
Retinalpigmentepitelet (RPE) är beläget mellan fotoreceptorer och choriokapillaris i det yttre skiktet av näthinnan1 med flera funktioner, inklusive att bilda blod-retinalbarriären, transportera och utbyta näringsämnen och retinala metaboliter, återvinna vitamin A för att upprätthålla en normal visuell cykel och fagocytos och clearance av shed-fotoreceptor yttre segment (POS)2,3 . Eftersom POS kräver konstant självförnyelse för att generera syn, måste RPE-cellerna kontinuerligt uppsluka fristående POS för att upprätthålla retinal homeostas4. Därför resulterar RPE-dysfunktion i många bländande ögonsjukdomar, såsom åldersrelaterad makuladegeneration (AMD)4, retinitis pigmentosa (RP)5, Leber medfödd amauros6, diabetisk retinopati7, etc. Hittills är den exakta patogenesen av de flesta av dessa sjukdomar fortfarande svårfångad. Som ett resultat etableras RPE-cellodling för att studera RPE-cellbiologi, patologiska förändringar och underliggande mekanismer.
Som den enklaste modellen för att studera cellbiologi startades odlingen av RPE-celler redan på 1920-talet8. Även om ARPE-19 används i stor utsträckning som RPE-celler, ger förlust av pigmentering, kullerstensmorfologi och särskilt barriärfunktionerna i denna cellinje upphov till många problem9. I jämförelse erbjuder kulturen av primära mänskliga RPE-celler ett mer realistiskt scenario för fysiologiska och patologiska studier9. Den relativt begränsade tillgängligheten begränsar dock deras användning och etiska problem finns alltid. Dessutom använde flera grupper musmodeller för att odla RPE-celler. Musögats storlek är dock liten, och en enda kultur kräver vanligtvis många möss, vilket inte är bekvämt9. Nyligen har forskare utvecklat nya metoder för att använda mänskliga embryonala stamceller eller inducerade pluripotenta stamceller för att härleda RPE-celler. Även om denna teknik har särskild potential för behandling av ärftliga RPE-störningar, är det tidskrävande och kräver vanligtvis flera månader för att generera mogna RPE-celler10. För att övervinna dessa problem introducerar vi här ett lätt att följa protokoll för att rutinmässigt isolera och odla RPE-celler med hög renhet i laboratoriet. Under lämpliga odlingsförhållanden kan dessa celler visa typiska RPE-funktioner och uppvisa typiska RPE-morfologier. Därför kan denna odlingsmetod ge en bra modell för att förstå RPE-fysiologi, studera cytotoxicitet, undersöka patologiska mekanismer för relaterade ögonsjukdomar och genomföra läkemedelsundersökningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här har ett detaljerat och optimerat protokoll för isolering, odling och karakterisering av RPE-celler från svinögonbollar, vilket genererar en bra modell för de vitro-karakterisering av RPE-celler och RPE-relaterade sjukdomsstudier beskrivits. Metoder för isolering av RPE från mänskliga, mus- och råttögon har beskrivits tidigare23,24,25. Det är dock svårt att få mänskliga ögonbollar i vissa laboratorier,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill visa sin tacksamhet och respekt för alla djur som bidrar med sina celler i denna studie. Denna studie stöddes delvis av bidrag från National Key R&D Program of China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao och Grant nr 2018YFA0107301, Wei Li). Författarna tackar Jingru Huang och Xiang You från Central Lab, School of Medicine, Xiamen University för tekniskt stöd inom konfokal avbildning.
Materials
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | – | – | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
Referências
- Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration. Redox Biology. 37, 101781 (2020).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. Gene therapy for retinitis pigmentosa. Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).
- den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Smith, D. T. Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino. The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- D’Antonio-Chronowska, A., D’Antonio, M., Frazer, K. A. In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE). Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- . Scientific, T Available from: https://www.thermofisher.cn/document-connect/document (2022)
- . Toyota Available from: https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf (2022)
- . Abcam Available from: https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol (2022)
- . Zeiss Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals (2022)
- . Cell Signal Technology Available from: https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western (2022)
- Wang, S., et al. Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).
- Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Physiology and function of the tight junction. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).
- Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix. Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).
- Sonoda, S. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
