Aloenxertos ortotópicos singênicos de adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) de camundongos recapitulam a biologia, os fenótipos e as respostas terapêuticas dos subtipos da doença. Devido à sua rápida e reprodutível progressão tumoral, são amplamente utilizados em estudos pré-clínicos. Aqui, mostramos práticas comuns para gerar esses modelos, injetando culturas de PDAC murino singênico no pâncreas.
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Artigo de método
Aloenxertos Ortotópicos Singênicos de Camundongos para Modelo de Câncer de Pâncreas
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Neste artigo
Resumo
Resumo
O adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) é uma doença muito complexa, caracterizada por um microambiente tumoral heterogêneo composto por um estroma diverso, células imunes, vasos, nervos e componentes da matriz extracelular. Ao longo dos anos, diferentes modelos de ADP em camundongos foram desenvolvidos para enfrentar os desafios impostos por sua progressão, potencial metastático e heterogeneidade fenotípica. Aloenxertos ortotópicos imunocompetentes de PDAC em camundongos têm se mostrado promissores devido à sua rápida e reprodutível progressão tumoral em comparação com modelos de camundongos geneticamente modificados. Além disso, combinados com sua capacidade de mimetizar as características biológicas observadas no ADP autóctone, modelos de camundongos aloenxertos ortotópicos baseados em linhagens celulares permitem experimentos in vivo em larga escala. Assim, esses modelos são amplamente utilizados em estudos pré-clínicos para análises rápidas genótipo-fenótipo e resposta a drogas. O objetivo deste protocolo é fornecer uma abordagem reprodutível e robusta para injetar com sucesso culturas primárias de células PDAC em camundongos no pâncreas de camundongos receptores singênicos. Além dos detalhes técnicos, são dadas informações importantes que devem ser consideradas antes da realização desses experimentos.
Introdução
Recentemente, o ADP tornou-se a terceira causa de morte relacionada ao câncer no mundo ocidental1. Causa a maior taxa de mortalidade entre todos os cânceres e uma taxa de sobrevida global de 10 anos de ~1%, que não mudou por décadas2. Devido à falta de progresso no tratamento do ADP, espera-se que essa doença se torne a segunda causa de mortes relacionadas ao câncer na próxima década3.
Os tumores PDAC são entidades complexas caracterizadas por um microambiente tumoral (ETM) diverso, composto por um conjunto heterogêneo de estroma, componentes vasculares, imunes e da matrizextracelular4. Diferenças na composição da ETM influenciam o prognóstico da doença e a resposta à terapia 4,5,6. De fato, muitos estudos têm demonstrado que o subtipo mesenquimal basal da ADP está associado a uma ETM altamente imunossupressora e apresenta diminuição da sobrevida e ausência de resposta às terapias7,8,9,10,11,12. Portanto, uma compreensão mais profunda das diferenças na composição da EMT e como essas características influenciam a biologia tumoral continua sendo um fator importante para o desenvolvimento de terapias molecularmente precisas. Para melhor compreender a biologia por trás desse fenótipo complexo e identificar estratégias terapêuticas capazes de superar a barreira que a ETM do ADP constitui, modelos in vivo são indispensáveis.
Um aspecto chave para qualquer sistema modelo pré-clínico de câncer é que ele deve mimetizar fenótipos humanos, recapitulando tanto a heterogeneidade genética quanto o meio incorporando a multiplicidade de populações estromais e imunes que compõem a TME. Portanto, ao escolher modelos de camundongos para pesquisa pré-clínica, vários aspectos devem ser levados em consideração. Para investigar a interação tumor-imune, linhagens histocompatíveis de células cancerosas podem ser injetadas em camundongos imunocompetentes singênicos. Na maioria dos casos, estes são injetados por via subcutânea no flanco do rato, permitindo fácil monitorização tumoral por palpação ou inspeção visual. No entanto, os modelos resultantes não mimetizam o crescimento de células tumorais em seu órgão de origem. Portanto, o transplante ortotópico tornou-se o padrão-ouro para modelos de aloenxerto.
Os aloenxertos ortotópicos de camundongos apresentam várias vantagens: são custo-efetivos, podem ser gerados com um procedimento relativamente simples e resultam em modelos com composição molecular conhecida, bem como uma progressão tumoral e fenótipo reprodutível e previsível. De fato, enquanto os modelos de xenoenxerto derivados do paciente representam o comportamento das células PDAC humanas com precisão, a necessidade de implantação em camundongos imunodeficientes para evitar a rejeição do enxerto limita a análise das interações tumor-imune e tumor-estroma, permitindo que os pesquisadores capturem apenas uma imagem parcial da complexidade desses tumores. Os aloenxertos ortotópicos singênicos de ADP apresentam uma vantagem nesse sentido também em comparação com modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMMs). Os GEMMs recapitulam com precisão a tumorigênese humana do ADP e a heterogeneidade observada em pacientes com ADP. No entanto, devido a essas características, os tumores GEMM podem apresentar alta variância em sua composição genética, progressão tumoral, agressividade, diferenciação histológica e composição da ETM. Embora isso possa ser uma vantagem em certos estudos, limita os estudos genótipo-fenótipo e a investigação focada dos fenótipos PDAC13. Portanto, aloenxertos ortotópicos de camundongos constituem um bom tradeoff e modelo para realizar estudos tumor-hospedeiro e tratamento in vivo. Este artigo descreve um protocolo para experimentos de transplante ortotópico de células PDAC murinas no pâncreas de camundongos.
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Protocolo
Os experimentos com animais foram aprovados pelos comitês institucionais de cuidados e uso de animais (IACUCs) das autoridades locais da Universidade Técnica de Munique e Regierung von Oberbayern.
1. Informações a considerar antes do procedimento
- Garantir a aprovação do protocolo animal e do pessoal pelas autoridades locais antes de iniciar qualquer experimentação animal.
- Selecione os mouses do destinatário.
- Selecionar camundongos de idades semelhantes para implantação (camundongos receptores C57Bl/6J com faixa etária entre 2 meses e 4 meses).
- Assegurar que o sexo e o background genético dos animais receptores correspondam ao sexo e ao background genético dos animais dos quais se originou a linhagem celular utilizada para a implantação (aloenxertos singênicos).
- Preparar os ratos para a implantação.
NOTA: Manusear os ratos de acordo com as normas de higiene do biotério local.- No dia do implante, não alimente os camundongos 4 h antes do procedimento para evitar complicações devido à administração de anestésicos.
- Pesar os ratos antes do implante para calcular a quantidade de anestésicos necessários.
- Transfira os ratos para a sala de cirurgia.
- Selecione as linhas de célula do PDAC.
- Certifique-se de que o fundo genético e o sexo dos camundongos dos quais as linhagens celulares são derivadas correspondam ao background e ao sexo dos camundongos receptores (por exemplo, as linhagens celulares PDAC PDAC 1-3 geradas anteriormente a partir de GEMMs PDAC em um fundo C57Bl/6J em laboratório com os seguintes genótipos, conforme descrito anteriormente14: PDAC 1 e 2: Ptf1aCre/+; LSL-KRASG12D/+; LSL-Trp53R172H/+, PDAC 3: Ptf1aCre/+; LSL-KRASG12D/+; LSL-Trp53 R172H/R172H).
- Selecione as linhagens celulares que não expressam proteínas potencialmente imunogênicas.
- Cultura de linhagens celulares PDAC.
NOTA: Execute o trabalho de cultura de células sob uma capela de fluxo laminar. Desinfete as luvas, o espaço de trabalho e os materiais antes de trabalhar.- Descongelar as células 1 semana antes do implante ressuspendendo o pellet em 5 mL de meio de cultura celular. Gire as células, aspirar o sobrenadante, ressuspender o pellet em 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e girar as células novamente. Retirar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de meio de Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 0,1% de penicilina-estreptomicina (PS). Transfira a suspensão celular para um balão de 25 cm².
- Passar as linhagens celulares pelo menos uma vez antes da implantação.
- Retirar o meio celular, lavar 1x com PBS e adicionar 0,5 mL de tripsina para retirar as células do frasco. Incubar as células a 37 °C até que se desprendam do balão (dependendo da linha celular, isto geralmente demora 5-10 min). Quando as células estiverem destacadas, ressuspendê-las em 10 mL de DMEM com SFB a 10% e PS a 0,1% e transferir a suspensão celular para um frasco de 75 cm².
NOTA: Como o FBS inativa a tripsina, isso dificultaria a tripsinização.
- Retirar o meio celular, lavar 1x com PBS e adicionar 0,5 mL de tripsina para retirar as células do frasco. Incubar as células a 37 °C até que se desprendam do balão (dependendo da linha celular, isto geralmente demora 5-10 min). Quando as células estiverem destacadas, ressuspendê-las em 10 mL de DMEM com SFB a 10% e PS a 0,1% e transferir a suspensão celular para um frasco de 75 cm².
- Garantir confluência de ~70%-80% no dia da implantação.
- Material necessário para implantação
- Autoclave de todos os instrumentos cirúrgicos.
- Mantenha os anestésicos prontos com base na licença de experimentação animal.
- Use meloxicam para analgesia com pelo menos 5 min de antecedência como um analgésico de longa duração com propriedades anti-inflamatórias.
- Para cirurgia, use uma combinação de midazolam, medetomidina, e fentanil (MMF) para analgosedação.
- Use uma combinação de atipamezole, flumazenil e naloxona (AFN) para antagonizar a analgosedação do MMF após o implante.
- Prepare um campo estéril, uma esteira de aquecimento, um barbeador, luvas, creme para os olhos, cloreto de sódio a 0,9%, esfoliação cirúrgica à base de iodo ou clorexidina, etanol a 80%, sutura solúvel, clipes para feridas, seringa de volume de injeção de 50 μL e fita adesiva.
2. Preparação das linhagens celulares antes da implantação
NOTA: Prepare as células tumorais somente quando os camundongos estiverem prontos para implantação. Garantir um curto período de tempo entre a colheita ou coleta das células e a implantação.
- Aquecer todos os líquidos a 37 °C antes de usar.
- Preparar as células (a partir de 1x T75 (um balão de cultura de 75 cm 2) conforme descrito no passo 1.5.2.1 até se desprenderem do balão. Ressuspender as células em 10 mL de DMEM com SFB a 10% e PS a 0,1% e transferir a suspensão celular para um tubo de 15 mL.
- Gire as células a 200 × g por 5 min em uma centrífuga. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em um volume adequado de DMEM sem aditivos com base na concentração final necessária das células para injeção. Use 10 μL da suspensão celular para contar as células usando uma câmara de Neubauer e calcular o número de células disponíveis.
- Diluir as células até o número final necessário de células para injeção (por exemplo, 2.500 células em 20 μL) em DMEM sem aditivos. Transferir 1 ml da suspensão celular diluída para um tubo de 1,5 ml. Coloque o tubo em um rotador até o implante para evitar que as células se agreguem.
3. Implantação ortotópica de células PDAC
OBS: Em caso de experiência cirúrgica insuficiente, pratique primeiro com cadáveres e obtenha treinamento adequado, por exemplo, dentro de um protocolo de treinamento de animais. O pessoal que realiza a cirurgia e os experimentos com animais precisa atender aos critérios das respectivas autoridades e às diretrizes institucionais.
- Utilizar meloxicam como analgésico perioperatório e aplicar 5 mg/kg de peso corporal por via subcutânea.
- Injetar MMF por via intraperitoneal de acordo com o peso corporal de cada camundongo (midazolam [5,0 mg/kg], medetomidina [0,5 mg/kg] e fentanil [0,05 mg/kg]).
- Coloque o mouse de volta na gaiola por 10-15 min.
- Aplique creme para os olhos quando o rato estiver a dormir.
- Verifique a analgosedação suficiente após 10 min, testando o reflexo de retirada do pedal (pinça nas almofadas dos pés de ambos os pés traseiros). Em caso de resposta, aplicar 1/3 da dose original de analgosedação. Após 10 min, repita o procedimento e prossiga apenas na ausência de um reflexo de retirada do pedal.
- Raspar o flanco abdominal lateral esquerdo do rato. Coloque o rato deitado do lado direito sobre um tapete de aquecimento estéril e tape as pernas na superfície. Desinfetar o abdome com uma esfoliação cirúrgica à base de iodo ou clorexidina, seguida de etanol 80% em movimento circular, e repetir o procedimento três vezes. Para manter a esterilidade do campo cirúrgico, use um campo cirúrgico.
- Use luvas novas e desinfete-as. Use tesoura cirúrgica para cortar a pele e o tecido adiposo subcutâneo longitudinalmente no flanco esquerdo, onde o baço é projetado. Realize um corte de cerca de 1 cm de comprimento.
- Usando tesoura e pinça, separe a pele do peritônio para facilitar o acesso ao peritônio.
- Troque o par de tesouras. Abra o peritônio no local do baço com um corte longitudinal de 1 cm.
- Mobilize o baço e o pâncreas aderido usando pinças rombas e de ponta fina. Certifique-se de que os órgãos não estão ligados a outros tecidos e verifique se há vasos sanguíneos para evitar ferir os vasos ou o tecido circundante ao manusear o pâncreas.
NOTA: Não pegue o baço diretamente para evitar sangramento. - Puxe cuidadosamente o pâncreas para fora da incisão para permitir um acesso mais fácil à cauda do órgão e observe o baço seguindo o pâncreas. Use a mão não dominante para agarrar o pâncreas com pinças e cortar cuidadosamente os ligamentos que impedem a extracorporalização do pâncreas. Certifique-se de que o órgão não é dobrado durante a injeção e que a cápsula do órgão é mantida sob tensão no local da penetração da agulha para evitar derramamento.
- Use a mão dominante para realizar a injeção. Penetre cuidadosamente na cápsula do órgão com a agulha da seringa seguindo o eixo longitudinal do órgão. Procure um pedaço de tecido pancreático entre os vasos sanguíneos visíveis para minimizar o risco de punção ou injeção em um vaso. Injetar lentamente um número adequado de células de acordo com o plano experimental (aqui, 2.500 células em 20 μL de DMEM) com uma cânula de 27 G e uma seringa de 50 μL na área da cauda do pâncreas.
NOTA: Uma bolha transparente se forma após a injeção bem-sucedida no tecido. - Mantenha o pâncreas e a seringa inserida imóvel por aproximadamente 1 min para evitar o derramamento das células tumorais. Retire cuidadosamente a agulha do local de injeção.
NOTA: Troque agulhas entre ratos e use uma nova seringa estéril para a injeção de uma nova linhagem celular. - Reorganize os órgãos dentro do abdômen cuidadosamente. Tome cuidado para não ferir o tecido para evitar o derramamento das células. Despeje 1 mL de cloreto de sódio a 0,9% sobre os órgãos para evitar a adesão do órgão.
- Suture cuidadosamente o peritônio usando a técnica de sutura interrompida simples e feche a pele com dois a três clipes de aço inoxidável de 9 mm.
NOTA: Remova os clipes da ferida 7 dias após o implante se a incisão cirúrgica tiver cicatrizado. - Se necessário, evitar a desidratação dos animais devido ao procedimento e à anestesia injetando 0,5 mL de cloreto de sódio por via subcutânea.
- Após o implante, antagoniza a analgosedação por MMF com injeção subcutânea de AFN (atipamezol [2,5 mg/kg], flumazenil [0,5 mg/kg], naloxon [1,2 mg/kg]), de acordo com o peso corporal do camundongo.
- Coloque o rato numa câmara aquecida a 37 °C até que esteja acordado e completamente activo. Em seguida, coloque o mouse de volta em sua gaiola original. Monitore o estado de saúde do mouse verificando o pelo, a cor da pele e a atividade e repita isso 3-4 h após a cirurgia.
4. Cuidados posteriores para os ratos
- Dê aos ratos acesso a água e comida quando voltarem à instalação animal.
- Continuar a aplicação subcutânea ou oral de meloxicam (5 mg/kg) a cada 6-12 h por 2-3 dias após a cirurgia.
- Monitorar o estado de saúde dos camundongos regularmente de acordo com o protocolo animal e as diretrizes institucionais.
- Dependendo do objetivo do experimento, monitore o crescimento do tumor a cada semana ou com mais frequência por meio de palpação, ultrassonografia, bioluminescência (BLI) ou ressonância magnética (RM).
NOTA: Com base no método de escolha, na taxa de crescimento e no número de células implantadas, um tumor pode ser detectado já 1 semana após a injeção.
5. Retirada de enxertos tumorais
- Colher os tumores ao final do experimento ou quando os camundongos precisarem ser eutanasiados seguindo os critérios dos comitês institucionais de cuidados e uso de animais ou licença de experimentação animal.
- Eutanásia do rato utilizando um método permitido pela licença de experimentação animal.
NOTA: Executar etapas com uma perda de tempo mínima para minimizar o tempo de isquemia. Portanto, a luxação cervical é recomendada, pois é um método rápido e o tempo de morte pode ser determinado exatamente, em contraste com o sangramento terminal ou métodos químicos. - Coloque o rato em decúbito dorsal sobre um tapete estéril e tape as pernas na superfície. Use etanol a 80% para desinfetar o abdômen.
- Use luvas novas e desinfete-as. Use tesoura cirúrgica para cortar a pele longitudinalmente no abdome central.
- Usando tesoura e pinça, separe a pele do peritônio para facilitar o acesso ao peritônio.
- Troque o par de tesouras. Abrir o peritônio no abdome central com corte longitudinal de 5 cm.
- Mobilize o baço e o pâncreas aderido usando pinças rombas e de ponta fina. Desprenda cuidadosamente o tumor do tecido circundante usando pinça e tesoura cirúrgica.
- Armazenar o tecido tumoral em um meio adequado para experimentos a jusante. Processar imediatamente os tecidos ou, se necessário, manter a amostra a 4 °C durante um máximo de 6 h até ao processamento posterior.
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Resultados
No contexto de um estudo de resposta a drogas em larga escala, implantamos com sucesso mais de 170 camundongos (camundongos receptores C75Bl6/J, machos e fêmeas com sexo pareado às linhagens celulares PDAC injetadas) usando o protocolo descrito acima, exemplificado em suas principais etapas na Figura 112. Neste protocolo, implantamos ortotopicamente três linhagens de células PDAC KrasG12D (PDAC 1 e 2: Ptf1aCre/+; LSL-KRASG12D/+<...
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Discussão
Os aloenxertos ortotópicos singênicos de camundongos representam um modelo robusto para estudos pré-clínicos devido ao custo-efetividade, reprodutibilidade e procedimentos experimentais relativamentesimples13,15. Esses modelos não só permitem o estudo das interações tumor-hospedeiro, mas também garantem a preservação da heterogeneidade genética dos tumores de onde se originam quando culturas primárias de células de camundongo são utilizadas para o experimento.
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer à instalação de animais TUM e à instalação de núcleo de imagem do Departamento de Medicina Nuclear, Klinikum rechts der Isar, pelo excelente suporte técnico. Este estudo foi apoiado pelo German Cancer Consortium (DKTK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SA 1374/4-2, DFG SA 1374/6-1, SFB 1321 Project-ID 329628492 P06, P11 e S01) para D.S., Wilhelm Sander-Stiftung (2020.174.1 e 2017.091.2) para D.S., e pelo Conselho Europeu de Pesquisa (ERC CoG No. 648521, para D.S.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cânula de 27 G | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Clipes de Aço Inoxidável para Enrolar, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Creme para os olhos (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanil (50 µ g/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0,1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidina (Sedador 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Seringa de microlitro | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxona (Naloxon-hameln 0,4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Penicilina-Estreptomicina | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Sutura (Ethilon) | Ethicon | ||
| Solução TrypZean 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
Referências
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (1), 7-30 (2020).
- Quaresma, M., Coleman, M. P., Rachet, B. 40-year trends in an index of survival for all cancers combined and survival adjusted for age and sex for each cancer in England and Wales, 1971-2011: A population-based study. Lancet. 385 (9974), 1206-1218 (2015).
- Rahib, L., Wehner, M. R., Matrisian, L. M., Nead, K. T. Estimated projection of US cancer incidence and death to 2040. JAMA Network Open. 4 (4), 214708(2021).
- Schneider, G., Schmidt-Supprian, M., Rad, R., Saur, D. Tissue-specific tumorigenesis: Context matters. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 239-253 (2017).
- Olive, K. P., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
- Ruscetti, M., et al. Senescence-induced vascular remodeling creates therapeutic vulnerabilities in pancreas cancer. Cell. 181 (2), 424-441 (2020).
- Aung, K. L., et al. Genomics-driven precision medicine for advanced pancreatic cancer: Early results from the COMPASS trial. Clinical Cancer Research. 24 (6), 1344-1354 (2018).
- Chan-Seng-Yue, M., et al. Transcription phenotypes of pancreatic cancer are driven by genomic events during tumor evolution. Nature Genetics. 52 (2), 231-240 (2020).
- Kalimuthu, S. N., et al. Morphological classification of pancreatic ductal adenocarcinoma that predicts molecular subtypes and correlates with clinical outcome. Gut. 69 (2), 317-328 (2020).
- Hayashi, A., et al. A unifying paradigm for transcriptional heterogeneity and squamous features in pancreatic ductal adenocarcinoma. Nature Cancer. 1 (1), 59-74 (2020).
- Mueller, S., et al. Evolutionary routes and KRAS dosage define pancreatic cancer phenotypes. Nature. 554 (7690), 62-68 (2018).
- Falcomata, C., et al. Selective multi-kinase inhibition sensitizes mesenchymal pancreatic cancer to immune checkpoint blockade by remodeling the tumor microenvironment. Nature Cancer. 3 (3), 318-336 (2022).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
- von Burstin, J., et al. E-cadherin regulates metastasis of pancreatic cancer in vivo and is suppressed by a SNAIL/HDAC1/HDAC2 repressor complex. Gastroenterology. 137 (1), 361-371 (2009).
- Mallya, K., Gautam, S. K., Aithal, A., Batra, S. K., Jain, M. Modeling pancreatic cancer in mice for experimental therapeutics. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1876 (1), 188554(2021).
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Reimpressões e permissões
