القياس الكمي التجريبي للتفاعلات بين أنظمة توصيل الدواء والخلايا في المختبر: دليل لتقييم الطب النانوي قبل السريري
Summary
يتم توضيح سير العمل للقياس الكمي المطلق للتفاعلات بين الخلايا الناقلة للأدوية باستخدام قياس التدفق الخلوي للسماح بتقييم عقلاني أفضل لأنظمة توصيل الأدوية الجديدة. ينطبق سير العمل هذا على ناقلات المخدرات من أي نوع.
Abstract
يتعلق أحد المكونات الرئيسية لتصميم أنظمة توصيل الأدوية بكيفية تضخيم أو تخفيف التفاعلات مع أنواع معينة من الخلايا. على سبيل المثال ، قد يعمل العلاج الكيميائي بجسم مضاد لتعزيز الارتباط بالخلايا السرطانية (“الاستهداف”) أو يعمل باستخدام البولي إيثيلين جلايكول للمساعدة في التهرب من التعرف على الخلايا المناعية (“التخفي”). حتى على المستوى الخلوي ، يعد تحسين ربط وامتصاص حامل الدواء مشكلة تصميم بيولوجية معقدة. ومن ثم، من المفيد فصل مدى قوة تفاعل الناقل الجديد مع الخلية عن الفعالية الوظيفية لبضاعة الناقل بمجرد تسليمها إلى تلك الخلية.
لمواصلة مثال العلاج الكيميائي ، فإن “مدى ارتباطها بخلية سرطانية” هي مشكلة منفصلة عن “مدى نجاحها في قتل خلية سرطانية”. المقايسات الكمية في المختبر لهذا الأخير راسخة وعادة ما تعتمد على قياس الجدوى. ومع ذلك ، فإن معظم الأبحاث المنشورة حول تفاعلات الناقل الخلوي هي نوعية أو شبه كمية. بشكل عام ، تعتمد هذه القياسات على وضع العلامات الفلورية للناقل ، وبالتالي الإبلاغ عن التفاعلات مع الخلايا في الوحدات النسبية أو التعسفية. ومع ذلك ، يمكن توحيد هذا العمل وجعله كميا تماما مع عدد صغير من تجارب التوصيف. مثل هذا القياس الكمي المطلق ذو قيمة ، لأنه يسهل المقارنات العقلانية بين الطبقات وداخلها لأنظمة توصيل الأدوية المختلفة – الجسيمات النانوية ، والجسيمات الدقيقة ، والفيروسات ، واتحادات الأجسام المضادة والأدوية ، والخلايا العلاجية المهندسة ، أو الحويصلات خارج الخلية.
علاوة على ذلك ، يعد القياس الكمي شرطا أساسيا للتحليلات التلوية اللاحقة أو في مناهج نمذجة السيليكو . في هذه المقالة ، يتم تقديم أدلة الفيديو ، بالإضافة إلى شجرة قرار حول كيفية تحقيق القياس الكمي في المختبر لأنظمة توصيل الأدوية الحاملة ، والتي تأخذ في الاعتبار الاختلافات في حجم الناقل وطريقة وضع العلامات. بالإضافة إلى ذلك ، تتم مناقشة المزيد من الاعتبارات للتقييم الكمي لأنظمة توصيل الأدوية المتقدمة. يهدف هذا إلى أن يكون بمثابة مورد قيم لتحسين التقييم العقلاني والتصميم للجيل القادم من الطب.
Introduction
اجتذب تصميم تركيبات توصيل الأدوية التي تظهر سلوكا محددا ومصمما اعتمادا على نوع الخلية التي تواجهها اهتماما بحثيا كبيرا. تشمل تركيبات توصيل الأدوية المحتملة أو “الناقلات” تركيبات الدهون ، أو المواد غير العضوية المزروعة بالنانو ، أو التجمعات البوليمرية ، أو الحويصلات خارج الخلية ، أو الخلايا البكتيرية الوظيفية ، أو الفيروسات المعدلة. كل هذه يمكن أن تظهر خصوصية العضو أو الأنسجة أو الخلية بسبب الخصائص الفيزيائية أو خصائص السطح أو الوظائف الكيميائية الهندسية مثل ارتباط الجسم المضاد 1,2.
تتمثل الخطوة المنتشرة في كل مكان تقريبا في تقييم الناقل في المختبر في احتضان الخلايا بتعليق يحتوي على الناقل المحمل بالمخدرات المذكور. بعد الحضانة ، يتم قياس أداء الناقل من خلال قراءة وظيفية لأداء شحنة الدواء ، على سبيل المثال ، كفاءة النقل أو السمية. القراءات الوظيفية مفيدة ، لأنها مقياس نهائي لفعالية الناقل. ومع ذلك ، بالنسبة لبنيات توصيل الأدوية الأكثر تعقيدا ، من المهم بشكل متزايد تجاوز القراءات الوظيفية وتحديد درجة تفاعل الناقل مع الخلية محل الاهتمام بشكل منفصل. هناك عدة أسباب لذلك.
أولا، هناك اهتمام متزايد باكتشاف (وتحسينها بشكل متكرر) تكنولوجيات الناقل “المنصات”، التي يمكن أن تحمل مجموعة متنوعة من البضائع. على سبيل المثال ، يمكن للجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) المصممة لتغليف الحمض النووي الريبي تبادل تسلسل RNA بآخر مع بعض المحاذير3. ومن ثم، ومن أجل تحسين تكنولوجيا الناقل بصورة متكررة، من الأهمية بمكان قياس أدائها بشكل مستقل عن وظيفة الشحنة. ثانيا، قد لا تكون القراءات الوظيفية مباشرة بالنسبة للبضاعة محل الاهتمام، مما يقوض القدرة على تكرار تركيبات الناقل وتقييمها بسرعة. في حين يمكن للمرء أن يؤدي في المختبر الأمثل باستخدام شحنة نموذجية مع قراءة وظيفية مباشرة (على سبيل المثال ، مضان) ، فإن تغيير الشحنة يمكن أن يغير الاستجابة البيولوجية للناقل4 وبالتالي قد لا يسفر عن نتائج تمثيلية. ثالثا ، تم تصميم العديد من الناقلات للتفاعل مع نوع معين من الخلايا واستيعابها. ويمكن، بل وينبغي، التمييز بين قدرة الناقل على الاستهداف هذه وأداء شحنته العلاجية بعد الاستهداف. لمواصلة مثال LNP ، قد تكون شحنة الحمض النووي الريبي قوية للغاية ، ولكن إذا كان LNP غير قادر على الارتباط بالخلية ، واستيعابه ، وإطلاق الحمض النووي الريبي ، فلن يلاحظ أي تأثير وظيفي في المصب. يمكن أن يكون هذا مشكلة خاصة بالنسبة للناقلات التي تهدف إلى استهداف أنواع الخلايا التي يصعب نقلها ، مثل الخلايا التائية5. على العكس من ذلك ، يمكن أن يستهدف LNP بشكل فعال للغاية ، لكن شحنة الحمض النووي الريبي قد لا تعمل. لن يتمكن الفحص النهائي الذي يقيس فقط وظائف الشحن من التمييز بين هاتين الحالتين ، مما يعقد تطوير وتحسين أنظمة توصيل الأدوية الناقلة.
في هذا العمل ، تتم مناقشة كيفية تحديد ارتباط الناقل بشكل مطلق. الارتباط هو مصطلح يشير إلى درجة التفاعل المقاسة تجريبيا بين الناقل والخلية. لا يفرق الارتباط بين ربط الغشاء والاستيعاب – قد يرتبط الناقل لأنه مرتبط بسطح الخلية أو لأن الخلية قد استوعبته. يقاس الارتباط عادة كجزء من تجارب حضانة حامل الخلية. تاريخيا ، تم الإبلاغ عن الارتباط إما في وحدات الفلورسنت التعسفية (عادة “متوسط شدة التألق” أو MFI) أو ك “ارتباط النسبة المئوية” ، وهي مقاييس تمت مناقشة حدودها سابقا6. باختصار ، هذه القياسات غير قابلة للمقارنة بين التجارب والمختبرات وناقلات الأدوية بسبب الاختلافات في البروتوكولات التجريبية ، وإعدادات مقياس التدفق الخلوي ، وشدة وضع العلامات على ناقلات مختلفة. وقد بذلت جهود للتغلب على الأول عن طريق معايرة مقياس الخلوي ، وبالتالي تحويل المقياس النسبي ل MFI إلى مقياس كمي تماما للتألق7. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لا تأخذ في الاعتبار التباين في كثافة وضع العلامات لمختلف شركات النقل ، وبالتالي ، لا تسمح بالمقارنة المنطقية لأداء الناقل المختلفة في خلية مستهدفة من الاختيار8.
هنا ، يتم توضيح كيفية التحويل عمليا من وحدات الفلورسنت النسبية التعسفية إلى المقياس الكمي المطلق ل “عدد الناقلات لكل خلية” من خلال إجراء عدد صغير من تجارب التوصيف الإضافية. إذا كان هناك مقياس آخر لتركيز الموجة الحاملة (على سبيل المثال ، كتلة الموجة الحاملة لكل خلية أو حجم الموجة الحاملة لكل خلية) ، فمن السهل التحويل من الناقلات لكل خلية ، بشرط أن يتم توصيف الناقل. للإيجاز وتجنب المصطلحات ، يتم استخدام كلمة “الناقل” في هذا العمل للإشارة إلى مجموعة واسعة من هياكل توصيل الأدوية. تقنيات القياس الكمي هذه قابلة للتطبيق بنفس القدر ، سواء تم تطبيقها على جسيمات الذهب المهندسة بالنانو أو البكتيريا المهندسة بيولوجيا.
بعض الحقائق تمكن من التحويل من وحدات الفلورسنت التعسفية إلى ناقلات لكل خلية. أولا ، تتناسب شدة التألق المقاسة مع تركيز الفلوروفور9 (أو الناقل المسمى بالفلورسنت) ، بافتراض أن التألق يقع ضمن حدود الكشف للأداة وأن إعدادات الأجهزة هي نفسها. وبالتالي ، إذا كان مضان الناقل ومضان العينة معروفين ، فيمكن للمرء تحديد عدد الناقلات الموجودة في تلك العينة إذا تم إجراء جميع القياسات في نفس الإعدادات والظروف. ومع ذلك ، خاصة بالنسبة للناقلات الأصغر ، قد لا يكون من الممكن قياس مضان الناقل ، والتألق الذاتي للخلية ، ومضان الخلية المرتبط بالناقلات على نفس الجهاز بنفس الإعدادات. في هذه الحالة ، هناك مطلب ثان لجعل من الممكن التحويل بين التألق المقاس على أداة واحدة والتألق المقاس على جهاز آخر. للقيام بذلك ، يمكن إنشاء منحنى قياسي لتركيز الفلوروفور لقياس شدة التألق على كلا الجهازين ، مع الاستفادة من جزيئات الفلوروكروم القابل للذوبان المكافئ (MESF) المعيار9. يسمح هذا بعد ذلك بقياس مضان الناقل بكميات كبيرة على مقياس غير خلوي ، وهو قياس يمكن إجراؤه على ناقلات من أي حجم أو خاصية. عندما يتم إجراء هذا التقدير الكمي السائب على تعليق ناقل بتركيز معروف ، يمكن مرة أخرى حساب عدد الناقلات لكل خلية من العينة.
بينما يوضح هذا العمل عملية قياس ارتباط الناقل (على النحو الذي تحدده شدة التألق المقاسة) ، يمكن إجراء بروتوكول مماثل لمقاييس أخرى للتفاعل بين الخلية والناقل (على سبيل المثال ، بروتوكول تجريبي يميز الناقلات الداخلية والحاملة الغشائية). بالإضافة إلى ذلك ، سيكون هذا البروتوكول هو نفسه إلى حد كبير إذا تم قياس الارتباط من خلال مقايسة غير فلورية (على سبيل المثال ، من خلال قياس الكتلة الخلوية).
Protocol
Representative Results
Discussion
أصبح توصيف التفاعلات بين ناقلات المخدرات والخلايا ذا أهمية متزايدة في تطوير أنظمة جديدة لتوصيل الأدوية. على وجه التحديد ، للسماح بالتقييم والمقارنة العقلانيين لمختلف هياكل الناقل ، فإن القياس الكمي المطلق لأداء الناقل المذكور للتفاعل مع الخلايا المستهدفة وغير المستهدفة أمر بالغ الأهمي…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وحظي هذا العمل بدعم المجلس الوطني الأسترالي للبحوث الصحية والطبية (NHMRC; منحة البرنامج رقم GNT1149990) ، المركز الأسترالي لأبحاث فيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد (ACH2) ، بالإضافة إلى هدية من تركة ريجان لويز لانجلوا. تقر F.C. بمنح زمالة الأبحاث الرئيسية العليا للمجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (NHMRC) (GNT1135806). تم إنشاء الشكل 1 والشكل 2 باستخدام BioRender.com.
Materials
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Invitrogen | A20347 | pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies |
| Apogee A50 Microflow | Apogee | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting | |
| CytoFLEX S Flow Cytometer | Beckman Coulter | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments | |
| FCS Express | De Novo Software | Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python | |
| Infinite 200 PRO | Tecan Lifesciences | Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment | |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis | |
| Prism 8 | GraphPad | Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others | |
| Quantum MESF kits Alexa Fluor 647 | Bangs Laboratories | 647 | Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard |
Referências
- Conde, J., et al. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Frontiers in Chemistry. 2, 48 (2014).
- Cheng, Q., et al. Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., DeRosa, F. The promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective. npj Vaccines. 5 (1), 1-6 (2020).
- Press, A. T., et al. Cargo-carrier interactions significantly contribute to micellar conformation and biodistribution. NPG Asia Materials. 9 (10), 444 (2017).
- Cevaal, P. M., et al. In vivo T cell-targeting nanoparticle drug delivery systems: Considerations for rational design. ACS Nano. 15 (3), 3736-3753 (2021).
- Faria, M., Johnston, S. T., Mitchell, A. J., Crampin, E., Caruso, F. Bio-nano science: Better metrics would accelerate progress. Chemistry of Materials. 33 (19), 7613-7619 (2021).
- Shin, H., Kwak, M., Geol Lee, T., Youn Lee, J. Quantifying the level of nanoparticle uptake in mammalian cells using flow cytometry. Nanoscale. 12 (29), 15743-15751 (2020).
- Lozano-Andrés, E., et al. Considerations for MESF-bead based assignment of absolute fluorescence values to nanoparticles and extracellular vesicles by flow cytometry. bioRxiv. , (2021).
- Schwartz, A., et al. Formalization of the MESF unit of fluorescence intensity. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 57 (1), 1-6 (2004).
- Faria, M., et al. Revisiting cell-particle association in vitro: A quantitative method to compare particle performance. Journal of Controlled Release. 307, 355-367 (2019).
- Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).
- Comfort, N., et al. Nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (169), e62447 (2021).
- Cui, J., et al. Immobilized particle imaging for quantification of nano- and microparticles. Langmuir. 32 (14), 3532-3540 (2016).
- Shang, J., Gao, X. Nanoparticle counting: Towards accurate determination of the molar concentration. Chemical Society Reviews. 43 (21), 7267-7278 (2014).
- Thomas, D. G., et al. ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems. Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6 (2018).
- Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions. The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221 (2020).
- Ahmed-Cox, A., et al. Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density. Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).
- Faria, M., et al. Minimum information reporting in bio-nano experimental literature. Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).
