Salmonella invaderar och replikerar inuti tarmepitelceller både i Salmonella-specifika vakuoler och fria i cytosolen (hyperreplikation). Ett fluorescensmikroskopibaserat protokoll med hög genomströmning beskrivs här för att kvantifiera de intracellulära fenotyperna av Salmonella genom två komplementära bildanalyser genom ImageJ, som når encellsupplösning och poängsättning.
Salmonella är en enterisk patogen som kan invadera tarmepitelet och replikera i enterocyter, både inuti Salmonella-specifika vakuoler och fria i cytosolen (cytosolisk hyperreplikation). Dessa olika fenotyper av intracellulär replikation driver till olika vägar för patogenes, dvs cytosolisk hyperreplikation inducerar inflammatorisk celldöd och extrudering i tarmlumen, medan vakuolär replikation leder till transepitelpenetration och systemisk spridning. Betydande ansträngningar gjordes för att skapa mikroskopiverktyg för att studera salmonellas beteende inuti invaderade celler, såsom pCHAR-Duo fluorescensreporterplasmid som möjliggör diskriminering mellan vakuolära och cytosoliska bakterier genom differentiellt uttryck av mCherry och GFP. Intracellulära fenotyper poängsätts emellertid ofta manuellt, en tidskrävande procedur som begränsar analysen till ett litet antal prover och celler. För att övervinna dessa begränsningar utvecklades två kompletterande och automatiserade bildanalyser med ImageJ, en fritt tillgänglig bildanalysprogramvara. I protokollet med hög genomströmning infekterades epitelceller med Salmonella som bär pCHAR-Duo med 96-brunnsplattor. Avbildning utfördes med hjälp av ett automatiserat fluorescensmikroskop. Därefter tillämpades två bildanalysmetoder för att mäta salmonellas intracellulära beteende på olika detaljnivåer. Den första metoden mäter den totala intracellulära bakteriebelastningen och omfattningen av cytosolisk hyperreplikation. Det är snabbt och möjliggör poängsättning av ett stort antal celler och prover, vilket gör det lämpligt för analyser med hög genomströmning, såsom screeningexperiment. Den andra metoden utför encellsanalys för att bestämma andelen infekterade celler, den genomsnittliga vakuolära belastningen av Salmonella och den cytosoliska hyperreplikationshastigheten som ger större detaljer om Salmonella-beteende inuti epitelceller. Protokollen kan utföras av specifikt utformade ImageJ-skript för att automatiskt köra batchanalyser av de viktigaste stegen i Salmonella-enterocytinteraktion.
Salmonella är det vanligaste rapporterade bakteriemedlet som orsakar utbrott av livsmedelsburna sjukdomar i Europeiska unionen1. Den primära patologiska manifestationen av Salmonella-infektion är enterit, vilket är resultatet av patogenbeteendet i tarmen efter intag och det därmed följande lokala inflammatoriska svaret2. Salmonella kan dock också spridas till extra-intestinala platser och orsaka systemisk infektion, särskilt hos immunkomprometterade individer. Typen av interaktion mellan Salmonella och tarmepitelet villkorar resultatet av infektionen. En gång i tarmlumen invaderar och replikerar Salmonella inuti tarmepitelceller. På intracellulär nivå kan Salmonella presentera två olika replikationsfenotyper, den cytosoliska hyperreplikationen och den intravakuolära långsamma replikationen inom salmonellainnehållande vakuoler (SCV). Den cytosoliska hyperreplikationen inducerar inflammatorisk värdcellsdöd och Salmonella-extrudering i tarmlumen3; Den vakuolära replikationen leder till en transepitelpenetration och systemisk spridning4. Därför påverkar omfattningen av invasion och vakuolär kontra cytosolisk replikation infektionsförloppet.
Släktet Salmonella är mycket varierat, inklusive tusentals serotyper med olika värdområden och förmågor att orsaka sjukdom. Till exempel S. Typhimurium definieras som en generalist serovar, eftersom den infekterar flera orelaterade värdar och representerar en av de främsta orsakerna till mänsklig salmonellos. Annorlunda, S. Derby anses vara en svinanpassad serovar, eftersom den mestadels är isolerad från svinen, men det rapporteras också i topp fem av de serovarer som är ansvariga för mänsklig infektion1. Kunskapen om bakteriebeteendet inuti epitelcellerna är emellertid i huvudsak begränsad till studier av några referensstammar, som S. Typhimurium SL1344, som inte representerar den stora naturliga mångfalden av Salmonella-patogenicitet. Att karakterisera interaktionen mellan olika stammar av Salmonella och epitelceller skulle bidra till att förstå deras olika patogenicitet. Av denna anledning utvecklades ett fluorescensmikroskopibaserat protokoll med hög genomströmning för att analysera det intracellulära beteendet hos ett stort antal stammar på ett snabbt och till stor del automatiserat sätt. I detta protokoll utfördes infektion av epitelceller i 96-brunns avbildningsplattor och bildförvärv gjordes med hjälp av ett automatiserat fluorescensmikroskop. pCHAR-Duo-plasmiden användes för att observera invasions- och replikationsfenotyperna av Salmonella inuti epitelceller genom fluorescerande mikroskopi5. Denna plasmid bär genen som kodar för den röda fluorescerande reportern mCherry, konstitutivt uttryckt av alla transformerade bakterieceller, och genen som kodar för den gröna fluorescerande reportern GFP, vars uttryck aktiveras av glukos-6-fosfat som uteslutande finns i cytosolen hos eukaryota celler och frånvarande i SCV. Därför tillåter plasmiden diskriminering mellan vakuolära och cytosoliska bakterier genom differentiellt uttryck av mCherry- och GFP-reportrar.
De vakuolära och cytosoliska bakterierna på mikroskopibilder kvantifieras vanligtvis med manuell poängsättning6, men detta är en tidskrävande metod som begränsar analysen till ett litet antal prover. Därför utvecklades två kompletterande och automatiserade bildanalyser med hjälp av ImageJ7, en fritt tillgänglig bildanalysprogramvara. Områdesanalysen mäter den totala intracellulära bakteriebelastningen och omfattningen av cytosolisk hyperreplikation genom att använda data från områden som upptas av epitelceller, röda och gröna Salmonellae i varje förvärvad mikroskopibild. Denna metod kan tillämpas på bilder som förvärvats med låg förstoring; Därför tillåter det att göra ett stort antal epitelceller med få bilder, vilket förkortar förvärvstiden. Encellsanalysen använder cellsegmentering för att bestämma andelen infekterade celler, den genomsnittliga vakuolära belastningen och andelen infekterade celler som genomgår cytosolisk hyperreplikation med encellsupplösning.
I detta protokoll beskrivs alla steg i bildanalysen i detalj som ska utföras manuellt, men samma analys kan automatiseras av våra specialdesignade ImageJ-skript. Dessa skript gör det också möjligt att köra batchanalyser för att automatiskt analysera flera bilder och därmed påskynda körningen av metoden.
Hur Salmonella koloniserar tarmepitelceller påverkar infektionsresultatet. Vid invasion inducerar den cytosoliska hyperreplikationen inflammation i tarmen3, medan vakuolär replikation kan leda till systemisk spridning4. Salmonellastammar kan variera i sin förmåga att invadera och replikera inuti tarmepitelceller9. Faktum är att Salmonella är ett extremt varierat släkte som omfattar mer än 2 500 serovarer, som har olika förmågor att orsaka sjukdom. Dessutom är Salmonella den vanligaste rapporterade orsaken till livsmedelsburna utbrott i Europeiska unionen, vilket tyder på en stor spridning i den mänskliga befolkningen1. Därför är tillgången till tillförlitliga metoder med hög genomströmning för kvantifiering av de intracellulära fenotyperna av Salmonella av stor betydelse för att utvärdera skillnader i virulens bland ett stort antal Salmonella-stammar och i slutändan möjliggöra en korrekt och stamspecifik riskbedömning av denna patogen.
Protokollet som beskrivs här mäter salmonellas beteende inuti epitelceller på ett snabbt och automatiserat sätt. Infektionen av epitelceller utförs i 96-brunnsavbildningsmikroplattor och ett automatiserat fluorescensmikroskop används för bildförvärv, vilket gör protokollet lämpligt för applikationer med hög genomströmning. Detta protokoll utnyttjar pCHAR-Duo-plasmiden, som gör det möjligt att skilja vakuolär från cytosolisk salmonella genom det differentiella uttrycket av två fluorescerande reportrar5. De intracellulära fenotyperna av Salmonella analyseras ofta genom manuell poängsättning, ett tidskrävande förfarande som är olämpligt för analys av ett stort antal stammar och cellkulturer per stam och benäget för operatörsfel och variation mellan operatörer. För att övervinna dessa begränsningar utvecklades två kompletterande och automatiserade bildanalyser, områdesanalysen och encellsanalysen. ImageJ, en fritt tillgänglig programvara, användes för att utveckla de två analyserna. För att påskynda protokollkörningen tillhandahålls ImageJ-skript för batchanalys av flera förvärvsfiler utan operatörsintervention som kompletterande filer.
Områdesanalysen utformades för att i några steg kvantifiera den totala koloniseringen av epitelceller (infektionsförhållande) och hyperreplikationsnivån (hyperreplikationsförhållandet) genom mätning av de områden som specifikt upptas av kärnorna i epitelceller och av Salmonellae som uttrycker antingen mCherry eller mCherry tillsammans med GFP. Områdesanalysen tillämpas på bilder som förvärvats vid låg förstoring, där både vakuolära och hyperreplikerande Salmonellae är i fokus i samma z-plan, och ett stort antal epitelceller visas per mikroskopiskt fält, vilket minskar storleken och antalet förvärvsfiler. Områdesanalysen möjliggör en automatiserad, snabb och beräkningslätt analys av ett stort antal prover, vilket gör den lämplig för analyser med hög genomströmning, såsom screeningexperiment.
Encellsanalysen utformades för att kvantifiera Salmonella-fenotyper inuti epitelceller med encellsupplösning, erhållen genom cellsegmentering och mätning av cellområdet och procentandelen yta som upptas av vakuolära och cytosoliska hyperreplikerande Salmonellae. Den totala koloniseringen av epitelceller som karakteriseras genom områdesanalysen är här uppdelad i tre kvantitativa parametrar, andelen infekterade celler, den genomsnittliga vakuolära belastningen och hyperreplikationshastigheten, vilket gör det möjligt att utvärdera och kvantifiera bidraget från varje fenotyp till den totala koloniseringen, vilket kompletterar resultaten av områdesanalysen. De större detaljerna som erbjuds av encellsanalysen kommer på bekostnad av långsammare bildförvärv och analys. För att uppnå encellsupplösning utförs bildförvärv vid hög förstoring. Detta innebär att flera z-plan behövs för att observera både vakuolära och cytosoliska Salmonellae i fokus och att förvärvet av ett stort antal fält per prov behövs för att poängsätta ett stort antal epitelceller, vilket förlänger förvärvstiden i jämförelse med områdesanalys. Dessutom är analysen av flera stora förvärvsfiler beräkningskrävande, vilket kräver en lämplig arbetsstation (en 6-kärnig, 32 GB RAM-arbetsstation användes). Därför kan encellsanalys användas som en fristående under begränsade genomströmningsförhållanden eller som en metod på andra nivån kopplad till områdesanalysen för att få en djupare förståelse för Salmonella-fenotyperna inuti epitelceller.
De två kompletterande analyserna validerades med hjälp av S. Tm, S. Derby wt, och S. Derby ΔsipA, vald eftersom deras beteende inuti epitelceller redan var känt för att skilja sig åt när det gäller invasion eller replikation 9,10. Resultaten av områdes- och encellsanalyserna visar att protokollet gjorde det möjligt att kvantitativt skilja skillnader i intracellulära Salmonella-fenotyper i enlighet med egenskaperna hos de testade stammarna. Dessutom visar dessa resultat att encellsanalysen möjliggör kvantifiering av bidraget från varje intracellulär fenotyp (invasion, vakuolär belastning och cytosolisk replikation) till den totala koloniseringen som poängsätts med hjälp av områdesanalysen.
Detta protokoll tillämpades här för att studera in vitro-patogenicitet hos olika salmonellastammar, men det kan ha andra tillämpningar som studier av slumpmässiga mutanter för att identifiera gener som är involverade i invasionen och / eller replikationen inuti epitelceller. Dessutom kan protokollet anpassas för att analysera salmonellas beteende i andra cellinjer än INT407-celler. Det kan också användas som utgångspunkt för att utveckla liknande metoder för att studera cell-patogeninteraktion mellan andra intracellulära mikroorganismer.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dr. Olivia Steele-Mortimer för att ha delat pCHAR-Duo plasmid. Detta arbete finansierades av det italienska hälsoministeriet, bidrag PRC2019014 och PRC2021004.
96-well imaging microplate | Eppendorf | 30741030 | Cell culture and infection |
Ampicillin | Sigma-Aldrich | 59349 | Bacteria culture |
Axio observer inverted microscope | ZEISS | Automated fluorescence microscope | |
Axiocam 305 Mono | ZEISS | Microscope Camera | |
Breathable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | Infection assay |
Colibrì 5/7 | ZEISS | Led light source | |
Collagen I rat tail | Life Technologies | A1048301 | Collagen coating |
DAPI | Invitrogen | D3571 | Cell staining |
Fetal bovine serum | Gibco | 10099-141 | Cell culture and infection |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G12664 | Infection assay |
Glacial acetic acid | Carlo Erba | 401391 | Collagen coating |
HCS CellMask Blue | Invitrogen | H32720 | Cell staining |
ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | Image processing software | |
Minimum Essential Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | M5650-500ML | Cell culture and infection |
Paraformaldehyde 4% | Invitrogen | FB002 | Cell fixation |
Potassium chloride | PanReac AppliChem | 131494.1211 | PBS preparation |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 60220 | PBS preparation |
Sodium Chloride | PanReac AppliChem | 131659.1214 | Bacteria culture and PBS preparation |
Sodium phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | PBS preparation |
Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap | Euroclone | ET7025 | Cell culture |
Triton X-100 | Biorad | 1610407 | Cell staining |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Cell culture and infection |
Tryptone | Oxoid | LP0042B | Bacteria culture |
Yeast extract | Biolife | 4122202 | Bacteria culture |