चूहों और चूहों में कंकाल की मांसपेशी थर्मोजेनेसिस को मापना
Summary
चूहों और चूहों को शल्य चिकित्सा द्वारा दूरस्थ तापमान ट्रांसपोंडर के साथ प्रत्यारोपित किया जाता है और फिर परीक्षण वातावरण और प्रक्रिया के लिए अभ्यस्त किया जाता है। मांसपेशियों के तापमान में परिवर्तन को घर के पिंजरे में औषधीय या प्रासंगिक उत्तेजनाओं के जवाब में या निर्धारित शारीरिक गतिविधि (यानी, ट्रेडमिल चलने को निरंतर गति से चलना) के जवाब में मापा जाता है।
Abstract
कंकाल की मांसपेशी थर्मोजेनेसिस चयापचय होमियोस्टैसिस और ऊर्जा व्यय के अंतर्निहित तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए एक संभावित एवेन्यू प्रदान करता है। आश्चर्यजनक रूप से थर्मोजेनेसिस के तंत्रिका, मायोसेलुलर और आणविक तंत्र को मांसपेशियों के तापमान में मापने योग्य परिवर्तनों से जोड़ने के लिए आश्चर्यजनक रूप से बहुत कम सबूत उपलब्ध हैं। यह पेपर एक विधि का वर्णन करता है जिसमें माउस और चूहे के कंकाल की मांसपेशियों के तापमान के प्रत्यक्ष माप को पुनः प्राप्त करने के लिए तापमान ट्रांसपोंडर का उपयोग किया जाता है।
दूरस्थ ट्रांसपोंडर को शल्य चिकित्सा द्वारा चूहों और चूहों की मांसपेशियों के भीतर प्रत्यारोपित किया जाता है, और जानवरों को ठीक होने का समय दिया जाता है। चूहों और चूहों को तब परीक्षण वातावरण और प्रक्रिया के लिए बार-बार आदत डालनी चाहिए। मांसपेशियों के तापमान में परिवर्तन को घर के पिंजरे में औषधीय या प्रासंगिक उत्तेजनाओं के जवाब में मापा जाता है। इन उत्तेजनाओं द्वारा प्रेरित मांसपेशियों के तापमान में परिवर्तन के योगदानकर्ताओं के रूप में गतिविधि में परिवर्तन को कारक बनाने के लिए निर्धारित शारीरिक गतिविधि (यानी, ट्रेडमिल चलना एक निरंतर गति से चलना) के दौरान मांसपेशियों के तापमान को भी मापा जा सकता है।
इस पद्धति का उपयोग मस्तिष्क, सहानुभूति तंत्रिका तंत्र और कंकाल की मांसपेशियों के स्तर पर मांसपेशी थर्मोजेनिक नियंत्रण अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। एक प्रासंगिक उत्तेजना के रूप में शिकारी गंध (पीओ; फेरेट गंध) का उपयोग करके इस सफलता के प्रदर्शन और फार्माकोलॉजिकल उत्तेजना के रूप में ऑक्सीटोसिन (ऑक्सीटी) के इंजेक्शन, जहां शिकारी गंध मांसपेशियों के थर्मोजेनेसिस को प्रेरित करती है, और ऑक्सीट मांसपेशियों के तापमान को दबा देती है। इस प्रकार, ये डेटासेट मांसपेशियों के तापमान में तेजी से परिवर्तन का पता लगाने में इस विधि की प्रभावकारिता प्रदर्शित करते हैं।
Introduction
चयापचय अनुसंधान के भीतर, कंकाल की मांसपेशी थर्मोजेनेसिस की परीक्षा शरीर के वजन होमियोस्टेसिस की जांच के लिए एक आशाजनक नया एवेन्यू है। प्रकाशित साहित्य इस विचार का समर्थन करता है कि शरीर के सबसे बड़े अंग प्रणालियों में से एक- कंकाल की मांसपेशी की थर्मोजेनिक प्रतिक्रियाएं ऊर्जा व्यय और अन्य चयापचय प्रभावों को बढ़ाने के लिए एक अवसर प्रदान करती हैं, जिससे मोटापा 1,2,3 जैसी बीमारियों के भीतर प्रणालियों को प्रभावी ढंग से पुनर्संतुलित किया जाता है। यदि मांसपेशियों को थर्मोजेनिक अंग माना जा सकता है, तो अध्ययन को इस अंग के भीतर थर्मोजेनिक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक व्यावहारिक पद्धति का उपयोग करना चाहिए। कंकाल की मांसपेशियों के एंडोथर्मिक प्रभाव को समझने की इच्छा और गैर-कंपकंपी मांसपेशी थर्मोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए इस पद्धति की उपयोगिता चयापचय अध्ययनों के लिए विशिष्ट नहीं है। विकास 4, तुलनात्मकशरीर विज्ञान5, और इकोफिजियोलॉजी 6,7 सहित विषयों ने उन तरीकों को समझने में निहित रुचि दिखाई है जिनमें मांसपेशी थर्मोजेनेसिस एंडोथर्मी में योगदान दे सकता है और यह तंत्र पर्यावरण के अनुकूल कैसे होता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल इन प्रश्नों को संबोधित करने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण तरीके प्रदान करता है।
प्रदान की गई विधि का उपयोग मांसपेशियों के तापमान के प्रासंगिक और औषधीय उत्तेजना मॉड्यूलेशन दोनों के मूल्यांकन में किया जा सकता है, जिसमें शिकारी खतरे को दोहराने के लिए संदर्भ को स्थानांतरित करने के लिए शिकारी गंध (पीओ) प्रदान करने की अनूठी तकनीक शामिल है। पूर्व रिपोर्टों ने मांसपेशियों के थर्मोजेनेसिस 8 में तेजी से वृद्धि को प्रेरित करने के लिए पीओ की क्षमता का प्रदर्शनकिया है। इसके अलावा, औषधीय उत्तेजनाएं मांसपेशियों के तापमान को भी बदल सकती हैं। यह पीओ-प्रेरित मांसपेशी थर्मोजेनेसिस के संदर्भ में प्रदर्शित किया गया है, जहां परिधीय β-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स की औषधीय नाकाबंदी, नाडोलोल का उपयोग करके, ट्रेडमिल चलने के दौरान सिकुड़ा हुआ थर्मोजेनेसिस को प्रभावित किए बिना मांसपेशियों के थर्मोजेनेसिस को प्रेरित करनेके लिए पीओ की क्षमता को रोक दिया। चूहों में मेलानोकोर्टिन रिसेप्टर एगोनिस्ट के केंद्रीय प्रशासन का उपयोग थर्मोजेनेसिस 9,10 को बदलने वाले मस्तिष्क तंत्र को समझनेके लिए भी किया गया है।
यहां चूहों में मांसपेशियों के थर्मोजेनेसिस को बदलने के लिए न्यूरोहार्मोन ऑक्सीटोसिन (ऑक्सीटी) की क्षमता की प्रारंभिक जांच की गई है। शिकारी खतरे के समान, एक समान-लिंग के साथ सामाजिक मुठभेड़ शरीर के तापमान में वृद्धि करती है, एक घटना जिसे सामाजिक हाइपरथर्मिया11 कहा जाता है। सामाजिक व्यवहार12 के लिए ऑक्सीट की प्रासंगिकता को देखते हुए, यह अनुमान लगाया गया है कि ऑक्सीट चूहों में सामाजिक हाइपरथर्मिया का मध्यस्थ है। दरअसल, एक ऑक्सीटोसिन रिसेप्टर विरोधी चूहों11 में सामाजिक हाइपरथर्मिया को कम करता है, और ऑक्सीट की कमी वाले माउस पिल्ले थर्मोजेनेसिस13 सहित थर्मोरेग्यूलेशन के व्यवहार और शारीरिक पहलुओं में कमी दिखाते हैं। यह देखते हुए कि हर्षव एट अल (2021) को सामाजिक हाइपरथर्मिया 11 के साथ ए 3 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर-निर्भर ब्राउन एडीपोज ऊतक (बीएटी) थर्मोजेनेसिस का समर्थन करने वाले सबूत नहीं मिले, यह माना गया है कि सामाजिक हाइपरथर्मिया ऑक्स्ट के मांसपेशी थर्मोजेनेसिस के प्रेरण से प्रेरित हो सकता है।
कंकाल की मांसपेशी थर्मोजेनेसिस को मापने के लिए, निम्नलिखित प्रोटोकॉल माउस या चूहे 8,10,14,15 के भीतर रुचि की मांसपेशियों से सटे प्रीप्रोग्राम्ड आईपीटीटी –300 ट्रांसपोंडर के आरोपण का उपयोग करता है। ये ट्रांसपोंडर ग्लास-एनकैप्सुलेटेड माइक्रोचिप्स हैं जिन्हें संबंधित ट्रांसपोंडर रीडर का उपयोग करके पढ़ा जाता है। इस क्षमता में बहुत कम शोध ने इस तकनीक का उपयोग नहीं किया है, हालांकि अध्ययनों ने इस पद्धति16,17 द्वारा प्रदान की गई विशिष्टता की आवश्यकता का सुझाव दिया है। पिछली जांचों ने इस विधि की विश्वसनीयता और विभिन्न तरीकों को दिखाया है जिसमें तापमान ट्रांसपोंडर का उपयोग अन्य तापमान-परीक्षण विधियों की तुलना मेंया शल्य चिकित्सा विधियों (जैसे, कैनुलाशन19) के साथ संयोजन में किया जा सकता है। हालांकि, इस प्रकृति के अध्ययन समग्र शरीर के तापमान20,21,22 या बीएटी 23,24,25 जैसे निर्दिष्ट ऊतकों को मापने के लिए विभिन्न रणनीतिक प्लेसमेंट पर निर्भर करते हैं।
इन स्थानों से तापमान को मापने के बजाय या कान या रेक्टल थर्मामीटर26 का उपयोग करते समय, यहां वर्णित विधि रुचि की मांसपेशियों के लिए विशिष्टता प्रदान करती है। रुचि की मांसपेशियों से सटे ट्रांसपोंडर को सीधे प्रत्यारोपित करके एक साइट को लक्षित करने की क्षमता विशेष रूप से मांसपेशी थर्मोजेनेसिस की जांच के लिए अधिक प्रभावी है। यह थर्मोकपल29 के माध्यम से सतह अवरक्त थर्मोमेट्री 27,28 या त्वचीय तापमान माप द्वारा प्रदान किए गए लोगों के अलावा एक नया एवेन्यू प्रदान करता है। इसके अलावा, इस विधि के माध्यम से प्रदान किए गए डेटा अनुसंधान के कई रास्ते प्रदान करते हैं, बड़े, महंगे, उच्च तकनीक वाले उपकरणों और इन्फ्रारेड थर्मोग्राफी30,31,32 जैसे सॉफ्टवेयर की आवश्यकता से बचते हैं।
इस विधि का उपयोग क्वाड्रिसेप्स और गैस्ट्रोकेनेमस में तापमान को मापने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है, या तो एकतरफा या द्विपक्षीय रूप से। यह विधि स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी14,15 के साथ संयोजन में भी प्रभावी रही है। ट्रांसपोंडर अंग के ~ 7-10 सेमी के भीतर, पोर्टेबल ट्रांसपोंडर रीडर (डीएएस -8027 / डीएएस -7007 आर) का उपयोग तापमान को स्कैन करने, मापने और प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है। यह दूरी पूर्व जांच 8,9,10 के लिए महत्वपूर्ण और मूल्यवान रही है क्योंकि यह परीक्षण प्रक्रियाओं के दौरान पशु हैंडलिंग जैसे संभावित तनाव और तापमान-परिवर्तन चर को कम करती है। टाइमर का उपयोग करके, माप को जानवरों के साथ सीधे बातचीत के बिना समय की अवधि में रिकॉर्ड और एकत्र किया जा सकता है।
परीक्षण के दौरान चूहों की गड़बड़ी को कम करने के लिए, यह विधि परीक्षण के दौरान प्रयोगकर्ता को घरेलू पिंजरों के तल तक पहुंच प्रदान करने के लिए पीवीसी पाइपिंग से बने राइजर के संयोजन और उपयोग का वर्णन करती है। डिजिटल रीडर के साथ मिलकर राइजर्स का उपयोग करके, उत्तेजना रखने के बाद ट्रांसपोंडर अंग के तापमान माप को किसी भी पशु संपर्क के बिना किया जा सकता है। न्यूनतम लागत पर, इस विधि का उपयोग औषधीय और प्रासंगिक उत्तेजनाओं के साथ संयोजन में किया जा सकता है, जिससे यह शोधकर्ताओं के लिए काफी सुलभ हो जाता है। इसके अतिरिक्त, इस विधि को एक समय में पर्याप्त संख्या में विषयों (~ 16 चूहों या ~ 12 चूहों) के साथ नियोजित किया जा सकता है, जिससे किसी भी शोध परियोजना के लिए समग्र थ्रूपुट बढ़ाने में समय की बचत होती है।
इस विधि में पेश किया गया स्टेनलेस स्टील जाल चाय इंफ्यूजर गेंदों का उपयोग करके चूहों को गंध पेश करने के लिए एक तैयार तंत्र है, जिसे अब से “चाय की गेंदों” के रूप में जाना जाता है। यद्यपि ये चाय की गेंदें किसी भी गंध सामग्री को शामिल करने के लिए आदर्श हैं, इन अध्ययनों में, तौलिए जो चूहों और चूहों के प्राकृतिक शिकारी फेरेट्स के लिए 2-3 सप्ताह में इन-केज बिस्तर के रूप में कार्य करते थे, प्रत्येक उपचार चाय की गेंद के भीतर रखे जाते हैं। प्रत्येक तौलिया को 5 सेमी x 5 सेमी वर्गों में काटा जाता है। इस एलिकोटिंग को अन्यथा समान गंधरहित नियंत्रण तौलिए के साथ भी दोहराया जाता है। बिना किसी बाधा (यानी, चाय की गेंद) के बिना इन गंधों को पेश करने से चूहों ने अपने पिंजरों के भीतर फाइबर को काट दिया, जिससे शारीरिक गतिविधि बढ़ गई। यह व्यवहार चूहों में उतना प्रमुख नहीं था। चाय की गेंदें तौलिया को हवादार आवरण प्रदान करती हैं, जिससे प्रयोगात्मक परीक्षण की संपूर्णता के लिए संरक्षित रहते हुए गंध तक पूर्ण पहुंच मिलती है। इन चाय की गेंदों को पशु उपयोग प्रोटोकॉल के अनुसार साफ किया जा सकता है, तैयार किया जा सकता है, और सर्जरी के बाद सीधे पेश किया जा सकता है ताकि जानवरों को नियंत्रण उत्तेजना के साथ संरचना में आदत डालना शुरू किया जा सके। चूहे तब अतिरिक्त संवर्धन के साथ रह सकते हैं, जिससे तीव्र उत्तेजना प्रस्तुति का महत्व कम हो जाता है।
चाय की गेंद की उपस्थिति के लिए आदत आदत का केवल एक पहलू है जो इस विधि के लिए महत्वपूर्ण है। वर्णित आदत प्रोटोकॉल में परीक्षण वातावरण को सामान्य करने के लिए परीक्षण प्रक्रिया के लिए बार-बार संपर्क भी शामिल है (यानी, कर्मियों, परिवहन और परीक्षण स्थान पर आंदोलन, उत्तेजना के संपर्क में)। यह विस्तारित आदत जानवरों से सूक्ष्म प्रतिक्रियाओं को कम करती है और वांछित निर्भर चर (जैसे, औषधीय या प्रासंगिक उत्तेजनाओं) पर माप केंद्रित करती है। इस प्रोटोकॉल के पिछले मूल्यांकन ने चूहों में घरेलू पिंजरों के भीतर तापमान परीक्षण से पहले आवश्यक आदतों की न्यूनतम संख्या के रूप में चार परीक्षणों की पहचानकी है। यदि परीक्षण को लंबी अवधि (2-3 सप्ताह से अधिक) से अलग किया जाता है, तो जानवरों को फिर से आदत होनी चाहिए। बार-बार आदत डालने के लिए, कम से कम एक से दो परीक्षण पर्याप्त हैं। हालांकि, यदि तापमान परीक्षणों को समय के अधिक लंबे समय तक अलग किया जाता है, तो अधिक परीक्षणों को दोहराना आवश्यक हो सकता है।
परीक्षण प्रक्रिया के लिए चूहों और चूहों को शामिल करने के निरंतर प्रयास में, उत्तेजना प्रस्तुति से पहले एक अनुकूलन अवधि को हर प्रयोगात्मक परीक्षण में शामिल किया जाना चाहिए। परीक्षण स्थान पर स्थानांतरित होने के बाद तापमान और गतिविधि को फिर से संतुलित करने के लिए यह अनुकूलन समय महत्वपूर्ण है। ट्रांसलोकेशन के कारण कृन्तकों में तेज तापमान बढ़ जाता है। औषधीय एजेंट या प्रासंगिक उत्तेजनाओं के किसी भी अतिरिक्त से पहले परीक्षण के दिन प्रयोगकर्ता से बातचीत के बिना अनुकूलन में न्यूनतम 1 घंटे शामिल होना चाहिए। यह परीक्षण के प्रत्येक दिन आवश्यक है।
उल्लिखित होम-पिंजरे तापमान परीक्षणों में, चूहों के पास परीक्षण किए गए उत्तेजना के जवाब में घूमने के लिए अपने घर के पिंजरे की मुक्त सीमा है। यह गतिविधि में परिवर्तनीय बदलाव का कारण बन सकता है, तापमान रीडिंग की सटीकता को प्रभावित कर सकता है और इसलिए, स्वतंत्र चर (जैसे, औषधीय या प्रासंगिक उत्तेजना) के थर्मोजेनिक प्रभावों का विश्लेषण। गतिविधि स्तर के कारण तापमान में संभावित परिवर्तनों की मान्यता में, ट्रेडमिल चलने के दौरान तापमान के उपयोग का वर्णन करने के लिए नीचे एक प्रोटोकॉल शामिल है। प्रकाशित साहित्य चूहों में इस प्रक्रिया के सफल उपयोग का वर्णन करता है, और यह वर्तमान मेंचूहों 8,10,14,15 के साथ नियोजित किया जा रहा है। ट्रेडमिल चलना परीक्षण विषय के लिए गतिविधि की निरंतर गति बनाए रखता है। इस अध्ययन के लिए, ट्रेडमिल का उपयोग गतिविधि के स्तर को नियंत्रित करने के लिए सख्ती से किया जाता है और इसलिए, चूहों के लिए चलने को बढ़ावा देने के लिए ट्रेडमिल पर सबसे कम उपलब्ध गति और चूहों के लिए इसी तरह की कम सेटिंग पर सेट किया जाता है।
चूहों में एकतरफा गैस्ट्रोकेनेमियस के तापमान माप और शिकारी गंध प्रस्तुति के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया को रेखांकित किया गया है। डिजाइन का उपयोग औषधीय एजेंटों के साथ संयोजन में किया जा सकता है और चूहों में चूहों और अन्य कंकाल की मांसपेशी समूहों (यानी, क्वाड्रिसेप्स) के लिए हस्तांतरणीय है। चूहों के लिए, ट्रांसपोंडर को गैस्ट्रोकेनेमस में द्विपक्षीय रूप से और भूरे रंग के वसा ऊतक में रखा जा सकता है। आकार और दूरी सीमाओं के कारण, प्रति माउस केवल एक ट्रांसपोंडर का उपयोग किया जा सकता है। औषधीय एजेंटों के लिए थर्मोजेनिक प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए मामूली संशोधन (जैसे, प्रासंगिक उत्तेजनाओं को हटाना) किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह तापमान परीक्षण प्रोटोकॉल क्षेत्र को सीधे कंकाल की मांसपेशी थर्मोजेनेसिस को मापने के लिए एक एवेन्यू प्रदान करता है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि अनुसंधान मांसपेशियों के थर्मोजेनेसिस33 के अंत…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम R15 DK097644 और R15 DK108668 द्वारा समर्थित है। हम पूर्व योगदान के लिए डॉ चैतन्य के गेविनी और डॉ मेगन रिच और संस्थागत पशु उपयोग दिशानिर्देशों के अनुपालन को सुनिश्चित करने के लिए डॉ स्टेनली डेनमिलर को धन्यवाद देते हैं। टिम बार्टनेस को इस पद्धति और इसके संबंधित अध्ययनों के निर्माण के लिए आवश्यक मौलिक अनुसंधान प्रदान करने के लिए एक विशेष धन्यवाद। आंकड़े 1 ए, सी, डी और चित्रा 2 ए Biorender.com का उपयोग करके बनाए गए थे।
Materials
| 1012M-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Mice, 2 Lanes w/ Shock | Columbus Instruments | ||
| 1012R-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Rats, 2 Lanes w/ Shock | Columbus Instruments | ||
| 1-1/4 in. Ratcheting PVC Cutter | BrassCraft | ||
| 1 mL Syringes | Fisher Scientific | BD 309659 | |
| Betadine Swabs | Fisher Scientific | 19-898-945 | |
| Booster Coil | BioMedic Data Systems | Transponder Accessory | |
| Electric Clippers | Andis | 40 Ultraedge Clipper Blade | |
| Flexible Mirror Sheets | Amazon | Self Adhesive Non Glass Mirror Tiles | |
| Forceps | Fisher Scientific | 89259-940 | |
| Heating Pad | |||
| Induction Chamber (isoflurane) | Kent Scientific | VetFlo-0730 | 3.0 L Low Cost Chambers for Traditional Vaporizers |
| Ketoprophen | Med-Vet Intl. | RXKETO-50 | |
| Magnetic Strips | Amazon | ||
| Magnets | Amazon | DIYMAG Magnetic Hooks 40lbs | |
| Needles | Med-Vet Intl. | 26400 | |
| Neomycin/Polymixin/Bacitracin with Hydrocortisone Ophthalmic Ointment, 3.5 g | Med-Vet Intl. | RXNPB-HC | |
| Oasis Absorbable Suture | Med-Vet Intl. | MV-H821-V | |
| Predator (Ferret) Odor Towels | Marshall BioResources | ||
| PVC pipe | |||
| Reflex Wound Clip Remover | CellPoint Scientific | ||
| Reflex Wound Clip, 7 mm (mouse) | CellPoint Scientific | ||
| Reflex Wound Clip, 9 mm (rat) | CellPoint Scientific | ||
| Srerile Autoclip, 7 mm (mouse) | CellPoint Scientific | Wound Clip Applier (mouse) | |
| Stainless Strainers Interval Seasonings Tea Infuser | Amazon | ||
| Sterile Autoclip, 9 mm (rat) | CellPoint Scientific | Wound Clip Applier (rat) | |
| Sterile Saline | Med-Vet Intl. | RX0.9NACL-10 | |
| Surgical Scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| Surgical Sheets | |||
| Towels (Control/Habituation) | Amazon | 100% Cotton Towels, white | |
| Transponders | BioMedic Data Systems | Model: IPTT-300 | |
| Transponders Reader | BioMedic Data Systems | Model: DAS-8027-IUS/ DAS-7007R | |
| Versaclean | Fisher Scientific | 18-200-700 | liquid detergent |
| Webcol Alcohol Preps | Covidien | 22-246-073 | |
| Wedge pieces for PVC pipe |
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