マウスとラットの骨格筋熱発生の測定
Summary
マウスとラットに遠隔温度トランスポンダーを外科的に移植し、試験環境と手順に慣れさせます。筋肉温度の変化は、ホームケージ内の薬理学的または文脈的刺激に応答して、または所定の身体活動中(すなわち、一定の速度で歩くトレッドミル)中に測定される。
Abstract
骨格筋の熱発生は、代謝恒常性とエネルギー消費の根底にあるメカニズムをよりよく理解するための潜在的な手段を提供します。熱発生の神経、心筋、および分子メカニズムを筋肉温度の測定可能な変化に直接結び付ける証拠は驚くほどほとんどありません。この論文では、温度トランスポンダを使用して、マウスとラットの骨格筋温度の直接測定値を取得する方法について説明します。
リモートトランスポンダーは、マウスとラットの筋肉内に外科的に埋め込まれ、動物には回復する時間が与えられます。その後、マウスとラットは、テスト環境と手順に繰り返し慣れる必要があります。筋肉温度の変化は、ホームケージ内の薬理学的または文脈的刺激に応答して測定されます。筋肉温度は、これらの刺激によって引き起こされる筋肉温度の変化に寄与する活動の変化を考慮に入れるために、所定の身体活動(すなわち、一定の速度で歩くトレッドミル)中に測定することもできます。
この方法は、脳、交感神経系、骨格筋のレベルで筋肉の熱発生制御のメカニズムを解明することに成功しています。捕食者臭(PO;フェレット臭)を文脈刺激として、オキシトシン(Oxt)を薬理刺激として注射し、捕食者臭が筋肉の熱発生を誘発し、Oxtが筋肉の温度を抑制するというこの成功のデモンストレーションを提供します。したがって、これらのデータセットは、筋肉温度の急激な変化を検出する上でのこの方法の有効性を示しています。
Introduction
代謝研究において、骨格筋の熱発生の検査は、体重の恒常性を調べるための有望な新しい手段です。公表された文献は、体の最大の臓器系の1つである骨格筋の熱発生反応が、エネルギー消費やその他の代謝効果を増加させる手段を提供し、それによって肥満などの疾患内のシステムのバランスを効果的に再調整するという考えを支持しています1,2,3。筋肉が熱発生器官と見なすことができる場合、研究はこの器官内の熱発生変化を研究するための実用的な方法論を利用する必要があります。骨格筋の吸熱の影響を理解したいという願望と、震えのない筋肉の熱発生を研究するためのこの方法論の有用性は、代謝研究に固有のものではありません。進化論4、比較生理学5、生態生理学6,7などの分野は、筋肉の熱発生が吸熱に寄与する方法と、このメカニズムが環境にどのように適応するかを理解することに既得権益を示しています。提示されたプロトコルは、これらの質問に対処するために必要な重要な方法を提供します。
提供された方法は、捕食者の脅威を再現するためにコンテキストをシフトするために捕食者臭(PO)を提供する独自の技術を含む、筋肉温度の文脈的および薬理学的刺激調節の両方の評価に利用することができる。以前の報告では、POが筋肉の熱発生の大幅な増加を急速に誘導する能力が実証されています8。さらに、薬理学的刺激も筋肉の温度を変化させる可能性があります。これは、ナドロールを使用した末梢βアドレナリン作動性受容体の薬理学的遮断が、トレッドミル歩行中の収縮性熱発生に大きな影響を与えることなく、POが筋肉熱発生を誘導する能力を阻害したPO誘発性筋熱発生の文脈で実証されています8。ラットにおけるメラノコルチン受容体アゴニストの中枢投与は、熱発生を変化させる脳のメカニズムを識別するためにも使用されています9,10。
ここでは、神経ホルモンのオキシトシン(Oxt)がマウスの筋肉の熱発生を変化させる能力の予備調査を提供します。捕食者の脅威と同様に、同性の同種との社会的遭遇は体温を上昇させ、社会的温熱療法11と呼ばれる現象です。Oxtと社会的行動との関連性を考えると12、Oxtはマウスの社会的温熱療法のメディエーターであると推測されています。実際、オキシトシン受容体拮抗薬はマウスの社会的温熱療法を減少させ11、Oxtを欠くマウスの子犬は、熱発生を含む体温調節の行動的および生理学的側面に欠損を示します13。Harshaw et al. (2021)がβ3アドレナリン受容体依存性褐色脂肪組織(BAT)の熱発生と社会的温熱療法11を支持する証拠を見つけられなかったことを考えると、社会的温熱療法はOxtの筋肉熱発生の誘導によって引き起こされる可能性があると仮定されています。
骨格筋の熱発生を測定するために、以下のプロトコルは、マウスまたはラット内の関心のある筋肉に隣接する事前にプログラムされたIPTT−300トランスポンダの移植を使用する8、10、14、15。これらのトランスポンダは、対応するトランスポンダリーダーを使用して読み取られるガラスカプセル化マイクロチップです。この能力でこの技術を利用した研究はほとんどまたはまったくありませんが、研究はこの方法によって提供される特異性の必要性を示唆しています16,17。以前の調査では、この方法の信頼性と、他の温度試験方法18と比較して、または外科的方法(例えば、カニュレーション19)と組み合わせて温度トランスポンダを使用できるさまざまな方法が示されています。ただし、この種の研究では、全体的な体温20,21,22またはBAT23,24,25などの特定の組織を測定するために、さまざまな戦略的配置に依存しています。
これらの場所から、または耳または直腸温度計26を使用しながら温度を測定するのではなく、ここで説明する方法は、対象の筋肉に対する特異性を提供する。対象の筋肉に隣接するトランスポンダを直接埋め込むことによって部位を標的にする機能は、筋肉の熱発生を特異的に調べるためにより効果的です。これは、表面赤外線温度測定27、28または熱電対29を介した皮膚温度測定によって提供されるものに加えて、新しい道を提供する。さらに、この方法を通じて提供されるデータは、赤外線サーモグラフィ30、31、32などの大規模で高価なハイテク機器およびソフトウェアの必要性を回避して、研究の範囲の手段を提供する。
この方法は、片側または両側で大腿四頭筋および腓腹筋の温度を測定するために首尾よく使用されています。この方法は、定位固定装置手術との併用でも有効である14,15。トランスポンダの手足から~7-10cm以内では、ポータブルトランスポンダリーダー(DAS-8027 / DAS-7007R)を使用して温度をスキャン、測定、および表示します。この距離は、潜在的なストレッサーや、試験手順中の動物の取り扱いなどの温度変化変数を最小限に抑えるため、以前の調査8,9,10にとって重要かつ貴重でした。タイマーを使用すると、動物と直接対話することなく、一定期間にわたって測定値を記録および収集できます。
テスト中のマウスの妨害をさらに最小限に抑えるために、この方法では、PVC配管で作られたライザーの組み立てと使用について説明し、テスト中に実験者がホームケージの底にアクセスできるようにします。ライザーをデジタルリーダーと組み合わせて使用すると、刺激が配置された後、動物の介入なしにトランスポンダの手足の温度測定を行うことができます。最小限のコストで、この方法は薬理学的および文脈的刺激と組み合わせて使用 することができ、研究者にとって非常にアクセスしやすいものになります。さらに、この方法は、一度にかなりの数の被験者(~16匹のマウスまたは~12匹のラット)で採用できるため、あらゆる研究プロジェクトの全体的なスループットを向上させる時間を節約できます。
この方法では、ステンレスメッシュのティーインフューザーボールを使用してマウスに匂いを提示するための細工されたメカニズムが導入され、今後は「ティーボール」と呼ばれます。これらのティーボールはあらゆる臭い物質を含むのに理想的ですが、これらの研究では、マウスとラットの天敵であるフェレットのケージ内寝具として2〜3週間にわたって使用されたタオルが各治療ティーボール内に配置されます。各タオルは5 cm x 5 cmの正方形にカットされます。この分注は、他の点では同一の無臭コントロールタオルでも繰り返されます。バリア(すなわち、ティーボール)なしでこれらの匂いを提示すると、マウスはケージ内の繊維を細断し、身体活動を増加させました。この行動はラットではそれほど顕著ではありませんでした。ティーボールはタオルに通気性のあるケーシングを提供し、実験試験全体にわたって保護されたまま、臭いに完全にアクセスできるようにします。これらのティーボールは、動物の使用プロトコルに従って消毒し、調製し、手術直後に導入して、対照刺激とともに動物を構造に馴化させることができます。その後、マウスは追加の濃縮で生きることができ、急性刺激提示の顕著性を低下させます。
ティーボールの存在への慣れは、この方法にとって重要な慣れの1つの側面にすぎません。記載された慣れプロトコルはまた、試験環境を正常化するための試験手順への反復暴露(すなわち、人員、試験場所への輸送および移動、刺激への曝露)からなる。この拡張された慣れは、動物からの微妙な反応を最小限に抑え、所望の従属変数(例えば、薬理学的または文脈的刺激)に測定を集中させる。このプロトコルの以前の評価では、ラット8のホームケージ内の温度テストの前に必要な最小限の慣れとして4つの試験が特定されました。テストが長期間(2〜3週間以上)離れている場合、動物は再び慣れなければなりません。繰り返し慣れさせるには、最低1〜2回の試行で十分です。ただし、温度テストがより長い時間で分離されている場合は、より多くの試行を繰り返す必要がある場合があります。
マウスとラットを試験手順に慣れさせるための継続的な努力において、刺激提示前の順応期間をすべての実験試験に含めるべきである。この順応時間は、テスト場所に移された後、温度と活動のバランスを取り戻すために重要です。げっ歯類は転座により急激な温度上昇が見られる傾向があります。順応は、薬理学的物質または文脈刺激を添加する前に、試験当日に実験者からの相互作用なしに最低1時間からなるべきである。これはテストの毎日必要です。
概説されたホームケージの温度テストでは、マウスはテストされた刺激に応答して歩き回るホームケージの放し飼いを持っています。これは、活性の変動を引き起こし、温度測定値の精度に影響を与え、したがって、独立変数の熱発生効果の分析(例えば、薬理学的または文脈的刺激)に影響を及ぼす可能性がある。活動レベルによる温度の潜在的な変化を認識して、トレッドミルウォーキング中の温度の使用を説明するプロトコルが以下に含まれています。公表された文献は、ラットにおけるこの手順の成功した使用を記載しており、現在、マウス8、10、14、15で採用されている。トレッドミルウォーキングは、被験者の活動速度を一定に維持します。この研究では、トレッドミルは活動レベルを制御するために厳密に使用されているため、マウスの歩行を促進するためにトレッドミルで利用可能な最低速度に設定され、ラットの同様に低い設定に設定されます。
以下の手順は、マウスにおける片側性腓腹筋の温度測定および捕食者の臭いの提示について概説されている。このデザインは薬理学的物質と組み合わせて使用 することができ、マウスのラットおよび他の骨格筋群(すなわち、大腿四頭筋)に転写可能である。ラットの場合、トランスポンダは両側性腓腹筋および褐色脂肪組織に配置することができます。サイズと距離の制限により、マウスごとに使用できるトランスポンダは1つだけです。薬理学的物質に対する熱発生応答を評価するために、軽微な修正(例えば、文脈刺激の除去)を行うことができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
この温度試験プロトコルは、骨格筋の熱発生を直接測定する手段を現場に提供します。これは、研究が筋肉の熱発生の根底にあるメカニズムを特定することを掘り下げるときに重要です33。この方法は、文脈的および薬理学的条件下で骨格筋の熱発生を測定するための2つの費用効果の高いプロトコルを提供します。このプロトコルは、これらの手順における慣れと順応の両?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、R15 DK097644 および R15 DK108668 によってサポートされています。以前の貢献をしてくれたチャイタニヤ・K・ガビニ博士とミーガン・リッチ博士、施設の動物使用ガイドラインを確実に遵守してくれたスタンリー・ダンネミラー博士に感謝します。この方法とそれに関連する研究を構築するために必要な基礎研究を提供してくれたティム・バートネス博士に特に感謝します。図1A、C、D、および図2Aは、Biorender.com を使用して作成されました。
Materials
| 1012M-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Mice, 2 Lanes w/ Shock | Columbus Instruments | ||
| 1012R-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Rats, 2 Lanes w/ Shock | Columbus Instruments | ||
| 1-1/4 in. Ratcheting PVC Cutter | BrassCraft | ||
| 1 mL Syringes | Fisher Scientific | BD 309659 | |
| Betadine Swabs | Fisher Scientific | 19-898-945 | |
| Booster Coil | BioMedic Data Systems | Transponder Accessory | |
| Electric Clippers | Andis | 40 Ultraedge Clipper Blade | |
| Flexible Mirror Sheets | Amazon | Self Adhesive Non Glass Mirror Tiles | |
| Forceps | Fisher Scientific | 89259-940 | |
| Heating Pad | |||
| Induction Chamber (isoflurane) | Kent Scientific | VetFlo-0730 | 3.0 L Low Cost Chambers for Traditional Vaporizers |
| Ketoprophen | Med-Vet Intl. | RXKETO-50 | |
| Magnetic Strips | Amazon | ||
| Magnets | Amazon | DIYMAG Magnetic Hooks 40lbs | |
| Needles | Med-Vet Intl. | 26400 | |
| Neomycin/Polymixin/Bacitracin with Hydrocortisone Ophthalmic Ointment, 3.5 g | Med-Vet Intl. | RXNPB-HC | |
| Oasis Absorbable Suture | Med-Vet Intl. | MV-H821-V | |
| Predator (Ferret) Odor Towels | Marshall BioResources | ||
| PVC pipe | |||
| Reflex Wound Clip Remover | CellPoint Scientific | ||
| Reflex Wound Clip, 7 mm (mouse) | CellPoint Scientific | ||
| Reflex Wound Clip, 9 mm (rat) | CellPoint Scientific | ||
| Srerile Autoclip, 7 mm (mouse) | CellPoint Scientific | Wound Clip Applier (mouse) | |
| Stainless Strainers Interval Seasonings Tea Infuser | Amazon | ||
| Sterile Autoclip, 9 mm (rat) | CellPoint Scientific | Wound Clip Applier (rat) | |
| Sterile Saline | Med-Vet Intl. | RX0.9NACL-10 | |
| Surgical Scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| Surgical Sheets | |||
| Towels (Control/Habituation) | Amazon | 100% Cotton Towels, white | |
| Transponders | BioMedic Data Systems | Model: IPTT-300 | |
| Transponders Reader | BioMedic Data Systems | Model: DAS-8027-IUS/ DAS-7007R | |
| Versaclean | Fisher Scientific | 18-200-700 | liquid detergent |
| Webcol Alcohol Preps | Covidien | 22-246-073 | |
| Wedge pieces for PVC pipe |
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