Medición de la termogénesis del músculo esquelético en ratones y ratas
Summary
Los ratones y las ratas se implantan quirúrgicamente con transpondedores de temperatura remotos y luego se habitúan al entorno y procedimiento de prueba. Los cambios en la temperatura muscular se miden en respuesta a estímulos farmacológicos o contextuales en la jaula del hogar o durante la actividad física prescrita (es decir, caminar en la cinta a una velocidad constante).
Abstract
La termogénesis del músculo esquelético proporciona una vía potencial para comprender mejor la homeostasis metabólica y los mecanismos subyacentes al gasto de energía. Sorprendentemente, hay poca evidencia disponible para vincular los mecanismos neurales, miocelulares y moleculares de la termogénesis directamente con cambios medibles en la temperatura muscular. Este documento describe un método en el que se utilizan transpondedores de temperatura para recuperar mediciones directas de la temperatura del músculo esquelético de ratón y rata.
Los transpondedores remotos se implantan quirúrgicamente dentro del músculo de ratones y ratas, y los animales tienen tiempo para recuperarse. Los ratones y las ratas deben habituarse repetidamente al entorno y procedimiento de prueba. Los cambios en la temperatura muscular se miden en respuesta a estímulos farmacológicos o contextuales en la jaula del hogar. La temperatura muscular también se puede medir durante la actividad física prescrita (es decir, caminar en la cinta a una velocidad constante) para tener en cuenta los cambios en la actividad como contribuyentes a los cambios en la temperatura muscular inducidos por estos estímulos.
Este método se ha utilizado con éxito para dilucidar los mecanismos subyacentes al control termogénico muscular a nivel del cerebro, el sistema nervioso simpático y el músculo esquelético. Se proporcionan demostraciones de este éxito utilizando el olor a depredador (PO; olor a hurón) como estímulo contextual e inyecciones de oxitocina (Oxt) como estímulo farmacológico, donde el olor a depredador induce la termogénesis muscular, y Oxt suprime la temperatura muscular. Por lo tanto, estos conjuntos de datos muestran la eficacia de este método para detectar cambios rápidos en la temperatura muscular.
Introduction
Dentro de la investigación metabólica, el examen de la termogénesis del músculo esquelético es una nueva vía prometedora para probar la homeostasis del peso corporal. La literatura publicada apoya la idea de que las respuestas termogénicas de uno de los sistemas de órganos más grandes del cuerpo, el músculo esquelético, proporcionan una vía para aumentar el gasto de energía y otros efectos metabólicos, reequilibrando así eficazmente los sistemas dentro de enfermedades como la obesidad 1,2,3. Si el músculo puede considerarse un órgano termogénico, los estudios deben utilizar una metodología práctica para estudiar los cambios termogénicos dentro de este órgano. El deseo de comprender el impacto endotérmico de los músculos esqueléticos y la utilidad de esta metodología para estudiar la termogénesis muscular sin temblores no son específicos de los estudios metabólicos. Disciplinas como la evolución4, la fisiología comparada5 y la ecofisiología 6,7 han mostrado un gran interés en comprender las formas en que la termogénesis muscular puede contribuir a la endotermia y cómo este mecanismo se adapta al medio ambiente. El protocolo presentado proporciona los métodos críticos necesarios para abordar estas preguntas.
El método proporcionado se puede utilizar en la evaluación de la modulación de estímulos contextuales y farmacológicos de la temperatura muscular, incluida la técnica única de proporcionar olor a depredador (PO) para cambiar el contexto para replicar la amenaza del depredador. Informes anteriores han demostrado la capacidad de PO para inducir rápidamente un aumento considerable en la termogénesis muscular8. Además, los estímulos farmacológicos también pueden alterar la temperatura muscular. Esto ha sido demostrado en el contexto de la termogénesis muscular inducida por PO, donde el bloqueo farmacológico de los receptores periféricos β-adrenérgicos, utilizando nadolol, inhibió la capacidad de PO para inducir la termogénesis muscular sin afectar significativamente la termogénesis contráctil durantela caminata en cinta 8. La administración central de agonistas del receptor de melanocortina en ratas también se ha utilizado para discernir los mecanismos cerebrales que alteran la termogénesis 9,10.
Aquí se proporciona una investigación preliminar de la capacidad de la neurohormona oxitocina (Oxt) para alterar la termogénesis muscular en ratones. Similar a la amenaza del depredador, los encuentros sociales con un conespecífico del mismo sexo aumentan la temperatura corporal, un fenómeno conocido como hipertermia social11. Dada la relevancia de Oxt para el comportamiento social12, se ha especulado que Oxt es un mediador de la hipertermia social en ratones. De hecho, un antagonista del receptor de oxitocina disminuye la hipertermia social en ratones11, y las crías de ratón que carecen de Oxt muestran déficits en los aspectos conductuales y fisiológicos de la termorregulación, incluida la termogénesis13. Dado que Harshaw et al. (2021) no encontraron evidencia que respalde la termogénesis del tejido adiposo marrón (BAT) dependiente del receptor adrenérgico β3 con hipertermia social11, se ha postulado que la hipertermia social puede ser impulsada por la inducción de Oxt de la termogénesis muscular.
Para medir la termogénesis del músculo esquelético, el siguiente protocolo utiliza la implantación de transpondedores IPTT-300 preprogramados adyacentes al músculo de interés dentro de un ratón o rata 8,10,14,15. Estos transpondedores son microchips encapsulados en vidrio que se leen utilizando los lectores de transpondedor correspondientes. Poca o ninguna investigación ha utilizado esta tecnología en esta capacidad, aunque los estudios han sugerido la necesidad de la especificidad proporcionada por este método16,17. Investigaciones anteriores han demostrado la fiabilidad de este método y una variedad de formas en que los transpondedores de temperatura pueden ser utilizados en comparación con otros métodos de prueba de temperatura18 o en conjunto con métodos quirúrgicos (por ejemplo, canulación19). Sin embargo, los estudios de esta naturaleza se basan en diferentes ubicaciones estratégicas para medir la temperatura corporal total 20,21,22 o tejidos específicos como BAT23,24,25.
En lugar de medir la temperatura desde estos lugares o mientras se usan termómetros de oído o rectales26, el método descrito aquí proporciona especificidad para el músculo de interés. La capacidad de apuntar a un sitio mediante la implantación directa de transpondedores adyacentes a los músculos de interés es más eficaz para sondear la termogénesis muscular específicamente. Proporciona una nueva vía además de las proporcionadas por la termometría infrarroja de superficie 27,28 o las mediciones de temperatura cutánea a través del termopar 29. Además, los datos proporcionados a través de este método ofrecen una gama de vías de investigación, evitando la necesidad de equipos y software grandes, costosos y de alta tecnología, como la termografía infrarroja30,31,32.
Este método se ha utilizado con éxito para medir la temperatura en los cuádriceps y gastrocnemios, ya sea unilateral o bilateralmente. Este método también ha sido efectivo en conjunto con la cirugía estereotáxica14,15. Dentro de ~7-10 cm de la extremidad del transpondedor, se utilizan lectores de transpondedor portátiles (DAS-8027/DAS-7007R) para escanear, medir y mostrar la temperatura. Esta distancia ha sido crítica y valiosa para investigaciones previas 8,9,10 porque minimiza los posibles factores estresantes y las variables que alteran la temperatura, como el manejo de los animales durante los procedimientos de prueba. Usando temporizadores, las mediciones se pueden registrar y recolectar durante un período de tiempo sin interacción directa con los animales.
Para minimizar aún más la perturbación de los ratones durante las pruebas, este método describe el ensamblaje y el uso de elevadores hechos de tuberías de PVC para dar al experimentador acceso al fondo de las jaulas domésticas durante la prueba. Usando los elevadores en conjunto con el lector digital, las mediciones de temperatura de la extremidad del transpondedor se pueden hacer sin ninguna interacción animal después de colocar el estímulo. A un costo mínimo, este método se puede utilizar junto con estímulos farmacológicos y contextuales, lo que lo hace bastante accesible para los investigadores. Además, este método se puede emplear con un número sustancial de sujetos (~ 16 ratones o ~ 12 ratas) a la vez, ahorrando tiempo en el aumento del rendimiento general para cualquier proyecto de investigación.
En este método se introduce un mecanismo diseñado para presentar olores a ratones utilizando bolas infusoras de té de malla de acero inoxidable, a partir de ahora denominadas “bolas de té”. Aunque estas bolas de té son ideales para contener cualquier material de olor, en estos estudios, las toallas que sirvieron como ropa de cama en la jaula durante 2-3 semanas para hurones, un depredador natural de ratones y ratas, se colocan dentro de cada bola de té de tratamiento. Cada toalla se corta en cuadrados de 5 cm x 5 cm. Esta alícuota también se repite con toallas de control inodoras idénticas. Presentar estos olores sin una barrera (es decir, bola de té) llevó a los ratones a triturar las fibras dentro de sus jaulas, aumentando la actividad física. Este comportamiento no fue tan destacado en ratas. Las bolas de té proporcionan una carcasa ventilada a la toalla, dando acceso completo al olor mientras se mantienen protegidos durante la totalidad del ensayo experimental. Estas bolas de té pueden desinfectarse de acuerdo con los protocolos de uso de animales, prepararse e introducirse directamente después de la cirugía para comenzar a habituar a los animales a la estructura junto con el estímulo de control. Los ratones pueden entonces vivir con el enriquecimiento adicional, disminuyendo la prominencia de la presentación del estímulo agudo.
La habituación a la presencia de la bola de té es sólo un aspecto de la habituación que es crítico para este método. El protocolo de habituación descrito también consiste en la exposición repetida al procedimiento de prueba para normalizar el entorno de prueba (es decir, personal, transporte y movimiento al lugar de prueba, exposición al estímulo). Esta habituación prolongada minimiza las respuestas matizadas de los animales y centra las mediciones en las variables dependientes deseadas (por ejemplo, estímulos farmacológicos o contextuales). La evaluación previa de este protocolo ha identificado cuatro ensayos como el número mínimo de habituaciones necesarias antes de las pruebas de temperatura dentro de las jaulas domésticas en ratas8. Si las pruebas están separadas por largos períodos (más de 2-3 semanas), los animales deben estar habituados nuevamente. Para la habituación repetida, un mínimo de uno o dos ensayos son suficientes. Sin embargo, si las pruebas de temperatura están separadas por períodos de tiempo más prolongados, puede ser necesario repetir más ensayos.
En el esfuerzo continuo para acostumbrar a ratones y ratas al procedimiento de prueba, se debe incluir un período de aclimatación antes de la presentación del estímulo en cada ensayo experimental. Este tiempo de aclimatación es crítico para reequilibrar la temperatura y la actividad después de ser trasladado al lugar de prueba. Los roedores tienden a tener fuertes aumentos de temperatura debido a la translocación. La aclimatación debe consistir en un mínimo de 1 h sin interacción del experimentador el día de la prueba antes de cualquier adición de un agente farmacológico o estímulos contextuales. Esto es necesario cada día de prueba.
En las pruebas de temperatura de la jaula en el hogar descritas, los ratones tienen el rango libre de su jaula doméstica para vagar en respuesta al estímulo probado. Esto puede causar cambios variables en la actividad, afectando la precisión de las lecturas de temperatura y, por lo tanto, el análisis de los efectos termogénicos de la variable independiente (por ejemplo, estímulo farmacológico o contextual). En reconocimiento de los posibles cambios en la temperatura debido al nivel de actividad, a continuación se incluye un protocolo que describe el uso de la temperatura durante la caminata en la cinta rodante. La literatura publicada describe el uso exitoso de este procedimiento en ratas, y actualmente se está empleando con ratones 8,10,14,15. La caminata en cinta mantiene una velocidad constante de actividad para el sujeto de prueba. Para este estudio, las cintas de correr se utilizan estrictamente para controlar el nivel de actividad y, por lo tanto, se establecen a la velocidad más baja disponible en la cinta para promover la marcha de ratones y una configuración igualmente baja para las ratas.
El siguiente procedimiento se describe para la medición de la temperatura de gastrocnemio unilateral en ratones y la presentación del olor del depredador. El diseño se puede usar junto con agentes farmacológicos y es transferible a ratas y otros grupos de músculos esqueléticos (es decir, cuádriceps) en ratones. Para ratas, los transpondedores se pueden colocar en el gastrocnemio bilateralmente y en el tejido adiposo marrón. Debido a las limitaciones de tamaño y distancia, solo se puede utilizar un transpondedor por ratón. Se pueden hacer modificaciones menores (por ejemplo, la eliminación de estímulos contextuales) para evaluar las respuestas termogénicas a los agentes farmacológicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo de prueba de temperatura proporciona al campo una vía para medir directamente la termogénesis del músculo esquelético. Esto es crítico a medida que la investigación profundiza en la identificación de los mecanismos subyacentes a la termogénesis muscular33. El método proporciona dos protocolos rentables para medir la termogénesis del músculo esquelético en condiciones contextuales y farmacológicas. Este protocolo enfatiza la importancia tanto de la habituación como de l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es compatible con R15 DK097644 y R15 DK108668. Agradecemos al Dr. Chaitanya K Gavini y a la Dra. Megan Rich por sus contribuciones anteriores y al Dr. Stanley Dannemiller por garantizar nuestro cumplimiento con las pautas institucionales de uso de animales. Un agradecimiento especial al Dr. Tim Bartness por proporcionar la investigación fundamental necesaria para construir este método y sus estudios asociados. Las figuras 1A, C, D y 2A se crearon utilizando Biorender.com.
Materials
| 1012M-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Mice, 2 Lanes w/ Shock | Columbus Instruments | ||
| 1012R-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Rats, 2 Lanes w/ Shock | Columbus Instruments | ||
| 1-1/4 in. Ratcheting PVC Cutter | BrassCraft | ||
| 1 mL Syringes | Fisher Scientific | BD 309659 | |
| Betadine Swabs | Fisher Scientific | 19-898-945 | |
| Booster Coil | BioMedic Data Systems | Transponder Accessory | |
| Electric Clippers | Andis | 40 Ultraedge Clipper Blade | |
| Flexible Mirror Sheets | Amazon | Self Adhesive Non Glass Mirror Tiles | |
| Forceps | Fisher Scientific | 89259-940 | |
| Heating Pad | |||
| Induction Chamber (isoflurane) | Kent Scientific | VetFlo-0730 | 3.0 L Low Cost Chambers for Traditional Vaporizers |
| Ketoprophen | Med-Vet Intl. | RXKETO-50 | |
| Magnetic Strips | Amazon | ||
| Magnets | Amazon | DIYMAG Magnetic Hooks 40lbs | |
| Needles | Med-Vet Intl. | 26400 | |
| Neomycin/Polymixin/Bacitracin with Hydrocortisone Ophthalmic Ointment, 3.5 g | Med-Vet Intl. | RXNPB-HC | |
| Oasis Absorbable Suture | Med-Vet Intl. | MV-H821-V | |
| Predator (Ferret) Odor Towels | Marshall BioResources | ||
| PVC pipe | |||
| Reflex Wound Clip Remover | CellPoint Scientific | ||
| Reflex Wound Clip, 7 mm (mouse) | CellPoint Scientific | ||
| Reflex Wound Clip, 9 mm (rat) | CellPoint Scientific | ||
| Srerile Autoclip, 7 mm (mouse) | CellPoint Scientific | Wound Clip Applier (mouse) | |
| Stainless Strainers Interval Seasonings Tea Infuser | Amazon | ||
| Sterile Autoclip, 9 mm (rat) | CellPoint Scientific | Wound Clip Applier (rat) | |
| Sterile Saline | Med-Vet Intl. | RX0.9NACL-10 | |
| Surgical Scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| Surgical Sheets | |||
| Towels (Control/Habituation) | Amazon | 100% Cotton Towels, white | |
| Transponders | BioMedic Data Systems | Model: IPTT-300 | |
| Transponders Reader | BioMedic Data Systems | Model: DAS-8027-IUS/ DAS-7007R | |
| Versaclean | Fisher Scientific | 18-200-700 | liquid detergent |
| Webcol Alcohol Preps | Covidien | 22-246-073 | |
| Wedge pieces for PVC pipe |
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