Mätning av skelettmuskeltermogenes hos möss och råttor
Summary
Möss och råttor opereras in med avlägsna temperaturtranspondrar och vänjer sig sedan vid testmiljön och proceduren. Förändringar i muskeltemperatur mäts som svar på farmakologiska eller kontextuella stimuli i hemburet eller under föreskriven fysisk aktivitet (dvs löpband som går med konstant hastighet).
Abstract
Skelettmuskeltermogenes ger en potentiell väg för bättre förståelse av metabolisk homeostas och de mekanismer som ligger till grund för energiförbrukning. Förvånansvärt lite bevis finns tillgängliga för att koppla de neurala, myocellulära och molekylära mekanismerna för termogenes direkt till mätbara förändringar i muskeltemperaturen. Detta dokument beskriver en metod där temperaturtranspondrar används för att hämta direkta mätningar av mus- och råttskelettmuskeltemperatur.
Avlägsna transpondrar implanteras kirurgiskt i muskeln hos möss och råttor, och djuren ges tid att återhämta sig. Möss och råttor måste sedan upprepade gånger vänja sig vid testmiljön och proceduren. Förändringar i muskeltemperatur mäts som svar på farmakologiska eller kontextuella stimuli i hemburet. Muskeltemperaturen kan också mätas under föreskriven fysisk aktivitet (dvs. löpbandsvandring med konstant hastighet) för att räkna ut förändringar i aktivitet som bidragsgivare till förändringarna i muskeltemperaturen som induceras av dessa stimuli.
Denna metod har framgångsrikt använts för att belysa mekanismer som ligger till grund för muskel termogen kontroll på nivå av hjärnan, sympatiska nervsystemet, och skelettmuskulaturen. Förutsatt är demonstrationer av denna framgång med hjälp av rovdjurslukt (PO; illerlukt) som en kontextuell stimulans och injektioner av oxytocin (Oxt) som en farmakologisk stimulans, där rovdjurslukt inducerar muskeltermogenes och Oxt undertrycker muskeltemperaturen. Således visar dessa datamängder effekten av denna metod för att upptäcka snabba förändringar i muskeltemperaturen.
Introduction
Inom metabolisk forskning är undersökningen av skelettmuskeltermogenes en lovande ny väg för att undersöka kroppsvikthomeostas. Den publicerade litteraturen stöder tanken att de termogena svaren hos ett av kroppens största organsystem – skelettmuskeln – ger en väg för att öka energiförbrukningen och andra metaboliska effekter och därmed effektivt balansera system inom sjukdomar som fetma 1,2,3. Om muskeln kan betraktas som ett tergent organ måste studier använda en praktisk metod för att studera termogena förändringar inom detta organ. Lusten att förstå den endotermiska effekten av skelettmuskler och nyttan av denna metod för att studera icke-skakande muskeltermogenes är inte specifika för metaboliska studier. Discipliner inklusive evolution4, jämförande fysiologi5 och ekofysiologi 6,7 har visat ett intresse av att förstå hur muskeltermogenes kan bidra till endotermi och hur denna mekanism anpassar sig till miljön. Det presenterade protokollet tillhandahåller de kritiska metoder som krävs för att ta itu med dessa frågor.
Den tillhandahållna metoden kan användas vid bedömningen av både kontextuell och farmakologisk stimuli modulering av muskeltemperatur, inklusive den unika tekniken att tillhandahålla rovdjurslukt (PO) för att flytta sammanhanget för att replikera rovdjurshot. Tidigare rapporter har visat PO: s förmåga att snabbt inducera en betydande ökning av muskeltermogenes8. Dessutom kan farmakologiska stimuli också förändra muskeltemperaturen. Detta har visats i samband med PO-inducerad muskeltermogenes, där farmakologisk blockad av perifera β-adrenerga receptorer, med användning av nadolol, hämmade PO: s förmåga att inducera muskeltermogenes utan att signifikant påverka kontraktil termogenes under löpbandsgång8. Central administrering av melanokortinreceptoragonister hos råttor har också använts för att urskilja hjärnmekanismer som förändrar termogenesen 9,10.
Här finns en preliminär undersökning av neurohormonet oxytocins (Oxt) förmåga att förändra muskeltermogenesen hos möss. I likhet med rovdjurshot ökar sociala möten med en samkönad samkönad kroppstemperatur, ett fenomen som kallas social hypertermi11. Med tanke på Oxts relevans för socialt beteende12 har det spekulerats i att Oxt är en medlare av social hypertermi hos möss. Faktum är att en oxytocinreceptorantagonist minskar social hypertermi hos möss11, och musungar som saknar Oxt visar underskott i beteendemässiga och fysiologiska aspekter av termoregulering, inklusive termogenes13. (2021) inte hittade bevis som stöder β3 adrenerg receptorberoende brun fettvävnad (BAT) termogenes med social hypertermi11, har det hävdats att social hypertermi kan drivas av Oxts induktion av muskeltermogenes.
För att mäta skelettmuskeltermogenes använder följande protokoll implantation av förprogrammerade IPTT-300-transpondrar intill muskeln av intresse i en mus eller råtta 8,10,14,15. Dessa transpondrar är glasinkapslade mikrochips som läses med motsvarande transponderläsare. Liten eller ingen forskning har använt denna teknik i denna kapacitet, även om studier har föreslagit ett behov av specificiteten som tillhandahålls av denna metod16,17. Tidigare undersökningar har visat tillförlitligheten hos denna metod och en mängd olika sätt på vilka temperaturtranspondrar kan användas i jämförelse med andra temperaturtestmetoder18 eller i samband med kirurgiska metoder (t.ex. kannulering19). Studier av detta slag är dock beroende av olika strategiska placeringar för att mäta den totala kroppstemperaturen 20,21,22 eller specificerade vävnader såsom BAT23,24,25.
I stället för att mäta temperaturen från dessa platser eller när du använder öron- eller rektaltermometrar26, ger metoden som beskrivs här specificitet för muskeln av intresse. Förmågan att rikta in sig på en plats genom att direkt implantera transpondrar intill musklerna av intresse är mer effektiv för att undersöka muskeltermogenes specifikt. Det ger en ny väg utöver de som tillhandahålls av ytinfraröd termometri 27,28 eller kutana temperaturmätningar via termoelement 29. Dessutom erbjuder de data som tillhandahålls genom denna metod en rad forskningsvägar, vilket undviker behovet av stor, dyr, högteknologisk utrustning och programvara som infraröd termografi30,31,32.
Denna metod har framgångsrikt använts för att mäta temperaturen i quadriceps och gastrocnemius, antingen ensidigt eller bilateralt. Denna metod har också varit effektiv i samband med stereotaxisk kirurgi14,15. Inom ~ 7-10 cm från transponderbenet används bärbara transponderläsare (DAS-8027 / DAS-7007R) för att skanna, mäta och visa temperaturen. Detta avstånd har varit kritiskt och värdefullt för tidigare undersökningar 8,9,10 eftersom det minimerar potentiella stressfaktorer och temperaturförändrande variabler som djurhantering under testförfarandena. Med hjälp av timers kan mätningar sedan registreras och samlas in under en tidsperiod utan direkt interaktion med djuren.
För att ytterligare minimera störningen av möss under testningen beskriver denna metod montering och användning av stigare av PVC-rör för att ge experimentören tillgång till botten av hemburarna under testningen. Med hjälp av stigarna i kombination med den digitala läsaren kan temperaturmätningar av transponderbenet göras utan någon djurinteraktion efter att stimulansen har placerats. Till en minimal kostnad kan denna metod användas tillsammans med farmakologiska och kontextuella stimuli, vilket gör den ganska tillgänglig för forskare. Dessutom kan denna metod användas med ett betydande antal försökspersoner (~ 16 möss eller ~ 12 råttor) åt gången, vilket sparar tid för att öka den totala genomströmningen för alla forskningsprojekt.
Introducerad i denna metod är en utformad mekanism för att presentera lukt för möss med hjälp av teinfusionsbollar i rostfritt stål, från och med nu kallade “tebollar”. Även om dessa tebollar är idealiska för att innehålla luktmaterial, placeras handdukar som fungerade som sängkläder i buren under 2-3 veckor för illrar, ett naturligt rovdjur av möss och råttor, i varje behandlingsteboll. Varje handduk skärs i 5 cm x 5 cm rutor. Denna alikvotering upprepas också med i övrigt identiska luktfria kontrollhanddukar. Att presentera dessa lukter utan barriär (dvs teboll) ledde till att möss strimlade fibrerna i sina burar, vilket ökade fysisk aktivitet. Detta beteende var inte lika framträdande hos råttor. Tebollar ger ett ventilerat hölje till handduken, vilket ger full tillgång till lukten samtidigt som de förblir skyddade under hela experimentförsöket. Dessa tebollar kan saneras i enlighet med djuranvändningsprotokoll, förberedas och introduceras direkt efter operationen för att börja vänja djuren till strukturen tillsammans med kontrollstimulansen. Möss kan då leva med den extra anrikningen, vilket minskar framträdandet av den akuta stimulanspresentationen.
Tillvänjning till närvaron av tebollen är bara en aspekt av tillvänjning som är avgörande för denna metod. Det beskrivna tillvänjningsprotokollet består också av upprepad exponering för testproceduren för att normalisera testmiljön (dvs. personal, transport och rörelse till testplatsen, exponering för stimulans). Denna utökade tillvänjning minimerar nyanserade svar från djuren och fokuserar mätningar på de önskade beroende variablerna (t.ex. farmakologiska eller kontextuella stimuli). Tidigare utvärdering av detta protokoll har identifierat fyra försök som det minsta antalet tillvänjningar som krävs före temperaturtestning i hemburar hos råttor8. Om testningen separeras av långa perioder (mer än 2-3 veckor) måste djuren vara vana igen. För upprepad tillvänjning räcker det med minst en till två försök. Men om temperaturtester separeras av mer långvariga anfall av tid kan det vara nödvändigt att upprepa fler försök.
I det fortsatta försöket att vänja möss och råttor vid testförfarandet bör en acklimatiseringsperiod före stimulanspresentation inkluderas i varje experimentell prövning. Denna acklimatiseringstid är avgörande för att balansera temperatur och aktivitet efter att ha flyttats till testplatsen. Gnagare tenderar att ha kraftiga temperaturökningar på grund av translokation. Acklimatisering bör bestå av minst 1 timme utan interaktion från experimentören på testdagen innan något tillsätts av ett farmakologiskt medel eller kontextuella stimuli. Detta är nödvändigt varje testdag.
I de skisserade temperaturtesterna i hemburen har möss fri räckvidd för sin hembur att ströva som svar på den testade stimulansen. Detta kan orsaka variabla förändringar i aktivitet, vilket påverkar noggrannheten i temperaturavläsningar och därmed analysen av de termogena effekterna av den oberoende variabeln (t.ex. farmakologisk eller kontextuell stimulans). Som ett erkännande av de potentiella temperaturförändringarna på grund av aktivitetsnivå ingår ett protokoll nedan som beskriver användningen av temperatur under löpbandsvandring. Den publicerade litteraturen beskriver den framgångsrika användningen av denna procedur hos råttor, och den används för närvarande med möss 8,10,14,15. Löpbandsgång upprätthåller en konstant aktivitetshastighet för testpersonen. För denna studie används löpband strikt för att kontrollera aktivitetsnivån och är därför inställda på den lägsta tillgängliga hastigheten på löpbandet för att främja promenader för möss och en liknande låg inställning för råttor.
Följande procedur beskrivs för temperaturmätning av ensidig gastrocnemius hos möss och rovdjursluktpresentation. Designen kan användas tillsammans med farmakologiska medel och kan överföras till råttor och andra skelettmuskelgrupper (dvs quadriceps) hos möss. För råttor kan transpondrar placeras i gastrocnemius bilateralt och i brun fettvävnad. På grund av storleks- och avståndsbegränsningar kan endast en transponder användas per mus. Mindre modifieringar (t.ex. avlägsnande av kontextuella stimuli) kan göras för att bedöma termogena svar på farmakologiska medel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta temperaturtestprotokoll ger fältet en väg att mäta skelettmuskeltermogenes direkt. Detta är kritiskt eftersom forskningen fördjupar sig i att identifiera mekanismerna bakom muskeltermogenes33. Metoden ger två kostnadseffektiva protokoll för att mäta skelettmuskeltermogenes under kontextuella och farmakologiska förhållanden. Detta protokoll betonar vikten av både tillvänjning och acklimatisering inom dessa förfaranden. Tillvänjning används för att upprepade gånger introducera…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av R15 DK097644 och R15 DK108668. Vi tackar Dr. Chaitanya K Gavini och Dr. Megan Rich för tidigare bidrag och Dr. Stanley Dannemiller för att säkerställa vår efterlevnad av riktlinjer för institutionell användning av djur. Ett särskilt tack till Dr. Tim Bartness för att tillhandahålla den grundläggande forskning som krävs för att bygga denna metod och dess tillhörande studier. Figurerna 1A, C, D och figur 2A skapades med hjälp av Biorender.com.
Materials
| 1012M-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Mice, 2 Lanes w/ Shock | Columbus Instruments | ||
| 1012R-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Rats, 2 Lanes w/ Shock | Columbus Instruments | ||
| 1-1/4 in. Ratcheting PVC Cutter | BrassCraft | ||
| 1 mL Syringes | Fisher Scientific | BD 309659 | |
| Betadine Swabs | Fisher Scientific | 19-898-945 | |
| Booster Coil | BioMedic Data Systems | Transponder Accessory | |
| Electric Clippers | Andis | 40 Ultraedge Clipper Blade | |
| Flexible Mirror Sheets | Amazon | Self Adhesive Non Glass Mirror Tiles | |
| Forceps | Fisher Scientific | 89259-940 | |
| Heating Pad | |||
| Induction Chamber (isoflurane) | Kent Scientific | VetFlo-0730 | 3.0 L Low Cost Chambers for Traditional Vaporizers |
| Ketoprophen | Med-Vet Intl. | RXKETO-50 | |
| Magnetic Strips | Amazon | ||
| Magnets | Amazon | DIYMAG Magnetic Hooks 40lbs | |
| Needles | Med-Vet Intl. | 26400 | |
| Neomycin/Polymixin/Bacitracin with Hydrocortisone Ophthalmic Ointment, 3.5 g | Med-Vet Intl. | RXNPB-HC | |
| Oasis Absorbable Suture | Med-Vet Intl. | MV-H821-V | |
| Predator (Ferret) Odor Towels | Marshall BioResources | ||
| PVC pipe | |||
| Reflex Wound Clip Remover | CellPoint Scientific | ||
| Reflex Wound Clip, 7 mm (mouse) | CellPoint Scientific | ||
| Reflex Wound Clip, 9 mm (rat) | CellPoint Scientific | ||
| Srerile Autoclip, 7 mm (mouse) | CellPoint Scientific | Wound Clip Applier (mouse) | |
| Stainless Strainers Interval Seasonings Tea Infuser | Amazon | ||
| Sterile Autoclip, 9 mm (rat) | CellPoint Scientific | Wound Clip Applier (rat) | |
| Sterile Saline | Med-Vet Intl. | RX0.9NACL-10 | |
| Surgical Scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| Surgical Sheets | |||
| Towels (Control/Habituation) | Amazon | 100% Cotton Towels, white | |
| Transponders | BioMedic Data Systems | Model: IPTT-300 | |
| Transponders Reader | BioMedic Data Systems | Model: DAS-8027-IUS/ DAS-7007R | |
| Versaclean | Fisher Scientific | 18-200-700 | liquid detergent |
| Webcol Alcohol Preps | Covidien | 22-246-073 | |
| Wedge pieces for PVC pipe |
Referências
- Periasamy, M., Herrera, J. L., Reis, F. C. G. Skeletal muscle thermogenesis and its role in whole body energy metabolism. Diabetes Metabolism Journal. 41 (5), 327-336 (2017).
- Rowland, L. A., Bal, N. C., Periasamy, M. The role of skeletal-muscle-based thermogenic mechanisms in vertebrate endothermy. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 90 (4), 1279-1297 (2015).
- Maurya, S. K., et al. Sarcolipin is a key determinant of the basal metabolic rate, and its overexpression enhances energy expenditure and resistance against diet-induced obesity. Journal of Biological Chemistry. 290 (17), 10840-10849 (2015).
- Grigg, G., et al. Whole-body endothermy: Ancient, homologous and widespread among the ancestors of mammals, birds and crocodylians. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 97 (2), 766-801 (2022).
- Franck, J. P. C., Slight-Simcoe, E., Wegner, N. C. Endothermy in the smalleye opah (Lampris incognitus): A potential role for the uncoupling protein sarcolipin. Comparative Biochemistry and Physiology – Part A: Molecular & Integrative Physiology. 233, 48-52 (2019).
- Nowack, J., et al. Muscle nonshivering thermogenesis in a feral mammal. Scientific Reports. 9, 6378 (2019).
- Oliver, S. R., Anderson, K. J., Hunstiger, M. M., Andrews, M. T. Turning down the heat: Down-regulation of sarcolipin in a hibernating mammal. Neuroscience Letters. 696, 13-19 (2019).
- Gorrell, E., et al. Skeletal muscle thermogenesis induction by exposure to predator odor. The Journal of Experimental Biology. 223, (2020).
- Gavini, C. K., et al. Leanness and heightened nonresting energy expenditure: Role of skeletal muscle activity thermogenesis. The American Journal of Physiology – Endocrinology and Metabolism. 306 (6), 635-647 (2014).
- Almundarij, T. I., Gavini, C. K., Novak, C. M. Suppressed sympathetic outflow to skeletal muscle, muscle thermogenesis, and activity energy expenditure with calorie restriction. Physiological Reports. 5 (4), 13171 (2017).
- Harshaw, C., Lanzkowsky, J., Tran, A. D., Bradley, A. R., Jaime, M. Oxytocin and ‘social hyperthermia’: Interaction with beta3-adrenergic receptor-mediated thermogenesis and significance for the expression of social behavior in male and female mice. Hormones and Behavior. 131, 104981 (2021).
- Caldwell, H. K. Oxytocin and vasopressin: Powerful regulators of social behavior. The Neuroscientist. 23 (5), 517-528 (2017).
- Harshaw, C., Leffel, J. K., Alberts, J. R. Oxytocin and the warm outer glow: Thermoregulatory deficits cause huddling abnormalities in oxytocin-deficient mouse pups. Hormones and Behavior. 98, 145-158 (2018).
- Gavini, C. K., Britton, S. L., Koch, L. G., Novak, C. M. Inherently lean rats have enhanced activity and skeletal muscle response to central melanocortin receptors. Obesity. 26 (5), 885-894 (2018).
- Gavini, C. K., Jones, W. C., Novak, C. M. Ventromedial hypothalamic melanocortin receptor activation: regulation of activity energy expenditure and skeletal muscle thermogenesis. The Journal of Physiology. 594 (18), 5285-5301 (2016).
- Zaretsky, D. V., Romanovsky, A. A., Zaretskaia, M. V., Molkov, Y. I. Tissue oxidative metabolism can increase the difference between local temperature and arterial blood temperature by up to 1.3(o)C: Implications for brain, brown adipose tissue, and muscle physiology. Temperature. 5 (1), 22-35 (2018).
- Yoo, Y., et al. Exercise activates compensatory thermoregulatory reaction in rats: A modeling study. Journal of Applied Physiology. 119 (12), 1400-1410 (2015).
- Langer, F., Fietz, J. Ways to measure body temperature in the field. Journal of Thermal Biology. 42, 46-51 (2014).
- Pence, S., et al. Central apolipoprotein A-IV stimulates thermogenesis in brown adipose tissue. International Journal of Molecular Sciences. 22 (3), 1221 (2021).
- Li, D., et al. Homeostatic disturbance of thermoregulatory functions in rats with chronic fatigue. Journal of Neuroscience Research. 165, 45-50 (2021).
- Carlier, J., et al. Pharmacodynamic effects, pharmacokinetics, and metabolism of the synthetic cannabinoid AM-2201 in male rats. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (3), 543-550 (2018).
- Pato, A. M., Romero, D. M., Sosa Holt, C. S., Nemirovsky, S. I., Wolansky, M. J. Use of subcutaneous transponders to monitor body temperature in laboratory rats. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 114, 107145 (2022).
- Almeida, D. L., et al. Lean in one way, in obesity another: Effects of moderate exercise in brown adipose tissue of early overfed male Wistar rats. International Journal of Obesity. 46 (1), 137-143 (2022).
- Brito, M. N., Brito, N. A., Baro, D. J., Song, C. K., Bartness, T. J. Differential activation of the sympathetic innervation of adipose tissues by melanocortin receptor stimulation. Endocrinology. 148 (11), 5339-5347 (2007).
- Vaughan, C. H., Shrestha, Y. B., Bartness, T. J. Characterization of a novel melanocortin receptor-containing node in the SNS outflow circuitry to brown adipose tissue involved in thermogenesis. Brain Research. 1411, 17-27 (2011).
- Kort, W. J., Hekking-Weijma, J. M., TenKate, M. T., Sorm, V., VanStrik, R. A microchip implant system as a method to determine body temperature of terminally ill rats and mice. Laboratory Animals. 32 (3), 260-269 (1998).
- Mei, J., et al. Body temperature measurement in mice during acute illness: Implantable temperature transponder versus surface infrared thermometry. Scientific Reports. 8, 3526 (2018).
- Warn, P. A., et al. Infrared body temperature measurement of mice as an early predictor of death in experimental fungal infections. Laboratory Animals. 37 (2), 126-131 (2003).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Fiebig, K., Jourdan, T., Kock, M. H., Merle, R., Thone-Reineke, C. Evaluation of infrared thermography for temperature measurement in adult male NMRI nude mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 57 (6), 715-724 (2018).
- Franco, N. H., Geros, A., Oliveira, L., Olsson, I. A. S., Aguiar, P. ThermoLabAnimal – A high-throughput analysis software for non-invasive thermal assessment of laboratory mice. Physiology & Behavior. 207, 113-121 (2019).
- Koganti, S. R., et al. Disruption of KATP channel expression in skeletal muscle by targeted oligonucleotide delivery promotes activity-linked thermogenesis. Molecular Therapy. 23 (4), 707-716 (2015).
- Bal, N. C., Periasamy, M. Uncoupling of sarcoendoplasmic reticulum calcium ATPase pump activity by sarcolipin as the basis for muscle non-shivering thermogenesis. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 375 (1793), 20190135 (2020).
- Hicks, C., et al. Body temperature and cardiac changes induced by peripherally administered oxytocin, vasopressin and the non-peptide oxytocin receptor agonist WAY 267,464: a biotelemetry study in rats. British Journal of Pharmacology. 171 (11), 2868-2887 (2014).
- Kasahara, Y., et al. Oxytocin receptor in the hypothalamus is sufficient to rescue normal thermoregulatory function in male oxytocin receptor knockout mice. Endocrinology. 154 (11), 4305-4315 (2013).
- Kasahara, Y., et al. Role of the oxytocin receptor expressed in the rostral medullary raphe in thermoregulation during cold conditions. Frontiers in Endocrinology. 6, 180 (2015).
- Yuan, J., Zhang, R., Wu, R., Gu, Y., Lu, Y. The effects of oxytocin to rectify metabolic dysfunction in obese mice are associated with increased thermogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 514, 110903 (2020).
- Scholl, J. L., Afzal, A., Fox, L. C., Watt, M. J., Forster, G. L. Sex differences in anxiety-like behaviors in rats. Physiology & Behavior. 211, 112670 (2019).
