Mesure de la thermogenèse des muscles squelettiques chez la souris et le rat

Summary

Les souris et les rats sont implantés chirurgicalement avec des transpondeurs de température à distance, puis habitués à l’environnement et à la procédure de test. Les changements de température musculaire sont mesurés en réponse à des stimuli pharmacologiques ou contextuels dans la cage familiale ou pendant l’activité physique prescrite (c.-à-d. la marche sur tapis roulant à une vitesse constante).

Abstract

La thermogenèse des muscles squelettiques offre une avenue potentielle pour mieux comprendre l’homéostasie métabolique et les mécanismes sous-jacents à la dépense énergétique. Étonnamment, peu de preuves sont disponibles pour relier les mécanismes neuronaux, myocellulaires et moléculaires de la thermogenèse directement aux changements mesurables de la température musculaire. Cet article décrit une méthode dans laquelle des transpondeurs de température sont utilisés pour récupérer des mesures directes de la température des muscles squelettiques de souris et de rats.

Des transpondeurs à distance sont implantés chirurgicalement dans le muscle des souris et des rats, et les animaux ont le temps de récupérer. Les souris et les rats doivent ensuite être habitués à plusieurs reprises à l’environnement et à la procédure de test. Les changements de température musculaire sont mesurés en réponse à des stimuli pharmacologiques ou contextuels dans la cage domestique. La température musculaire peut également être mesurée pendant l’activité physique prescrite (c.-à-d. la marche sur tapis roulant à une vitesse constante) pour tenir compte des changements d’activité qui contribuent aux changements de température musculaire induits par ces stimuli.

Cette méthode a été utilisée avec succès pour élucider les mécanismes sous-jacents au contrôle thermogénique musculaire au niveau du cerveau, du système nerveux sympathique et du muscle squelettique. Des démonstrations de ce succès sont fournies en utilisant l’odeur de prédateur (PO; odeur de furet) comme stimulus contextuel et des injections d’ocytocine (Oxt) comme stimulus pharmacologique, où l’odeur de prédateur induit la thermogenèse musculaire et Oxt supprime la température musculaire. Ainsi, ces ensembles de données montrent l’efficacité de cette méthode dans la détection des changements rapides de température musculaire.

Introduction

Dans le cadre de la recherche métabolique, l’examen de la thermogenèse des muscles squelettiques est une nouvelle avenue prometteuse pour sonder l’homéostasie du poids corporel. La littérature publiée soutient l’idée que les réponses thermogéniques de l’un des plus grands systèmes organiques du corps – le muscle squelettique – fournissent un moyen d’augmenter la dépense énergétique et d’autres effets métaboliques, rééquilibrant ainsi efficacement les systèmes au sein de maladies telles que l’obésité ^1,2,3. Si le muscle peut être considéré comme un organe thermogénique, les études doivent utiliser une méthodologie pratique pour étudier les changements thermogéniques dans cet organe. Le désir de comprendre l’impact endothermique des muscles squelettiques et l’utilité de cette méthodologie pour étudier la thermogenèse musculaire non frissonnante ne sont pas spécifiques aux études métaboliques. Des disciplines telles que l’évolution⁴, la physiologie comparative⁵ et l’écophysiologie ^6,7 ont montré un intérêt direct à comprendre comment la thermogenèse musculaire peut contribuer à l’endothermie et comment ce mécanisme s’adapte à l’environnement. Le protocole présenté fournit les méthodes critiques nécessaires pour répondre à ces questions.

La méthode fournie peut être utilisée dans l’évaluation de la modulation contextuelle et pharmacologique des stimuli de la température musculaire, y compris la technique unique consistant à fournir une odeur de prédateur (PO) pour modifier le contexte afin de reproduire la menace du prédateur. Des rapports antérieurs ont démontré la capacité de la PO à induire rapidement une augmentation considérable de la thermogenèse musculaire⁸. De plus, les stimuli pharmacologiques peuvent également modifier la température musculaire. Cela a été démontré dans le contexte de la thermogenèse musculaire induite par PO, où le blocage pharmacologique des récepteurs périphériques β-adrénergiques, à l’aide de nadolol, a inhibé la capacité de PO à induire la thermogenèse musculaire sans affecter de manière significative la thermogenèse contractile pendant la marche sur tapis^{roulant 8}. L’administration centrale d’agonistes des récepteurs de la mélanocortine chez le rat a également été utilisée pour discerner les mécanismes cérébraux altérant la thermogenèse ^9,10.

Voici une étude préliminaire de la capacité de la neurohormone ocytocine (Oxt) à modifier la thermogenèse musculaire chez la souris. Semblable à la menace des prédateurs, les rencontres sociales avec un conspécifique de même sexe augmentent la température corporelle, un phénomène appelé hyperthermie sociale¹¹. Compte tenu de la pertinence d’Oxt pour le comportement social¹², il a été spéculé qu’Oxt est un médiateur de l’hyperthermie sociale chez la souris. En effet, un antagoniste des récepteurs de l’ocytocine diminue l’hyperthermie sociale chez la souris¹¹, et les petits souris dépourvus d’Oxt présentent des déficits dans les aspects comportementaux et physiologiques de la thermorégulation, y compris la thermogenèse¹³. Étant donné que Harshaw et coll. (2021) n’ont pas trouvé de preuves à l’appui de la thermogenèse du tissu adipeux brun (MTD) dépendante des récepteurs adrénergiques β3 avec hyperthermie sociale¹¹, il a été postulé que l’hyperthermie sociale pourrait être entraînée par l’induction de la thermogenèse musculaire par Oxt.

Pour mesurer la thermogenèse du muscle squelettique, le protocole suivant utilise l’implantation de transpondeurs IPTT-300 préprogrammés adjacents au muscle d’intérêt chez une souris ou un rat 8,10,14,15. Ces transpondeurs sont des micropuces encapsulées dans du verre qui sont lues à l’aide des lecteurs de transpondeur correspondants. Peu ou pas de recherche a utilisé cette technologie à ce titre, bien que des études aient suggéré la nécessité de la spécificité fournie par cette méthode^16,17. Des études antérieures ont montré la fiabilité de cette méthode et diverses façons d’utiliser les transpondeurs de température par rapport à d’autres méthodes d’essai de température¹⁸ ou en conjonction avec des méthodes chirurgicales (par exemple, canulation¹⁹). Cependant, les études de cette nature reposent sur différents emplacements stratégiques pour mesurer la température corporelle globale 20,21,22 ou des tissus spécifiés tels que BAT^23,24,25.

Plutôt que de mesurer la température à partir de ces endroits ou à l’aide de thermomètres auriculaires ou rectaux²⁶, la méthode décrite ici fournit une spécificité pour le muscle d’intérêt. La capacité de cibler un site en implantant directement des transpondeurs adjacents aux muscles d’intérêt est plus efficace pour sonder spécifiquement la thermogenèse musculaire. Il offre une nouvelle voie en plus de celles fournies par la thermométrie infrarouge de surface ^27,28 ou les mesures de température cutanée via thermocouple ²⁹. En outre, les données fournies par cette méthode offrent une gamme de pistes de recherche, évitant le besoin d’équipements et de logiciels de haute technologie coûteux tels que la thermographie infrarouge^30,31,32.

Cette méthode a été utilisée avec succès pour mesurer la température dans les quadriceps et le gastrocnémien, unilatéralement ou bilatéralement. Cette méthode s’est également avérée efficace en conjonction avec la chirurgie stéréotaxique^14,15. À ~7-10 cm du membre du transpondeur, des lecteurs de transpondeur portables (DAS-8027/DAS-7007R) sont utilisés pour scanner, mesurer et afficher la température. Cette distance a été critique et précieuse pour les études antérieures ^8,9,10 parce qu’elle minimise les facteurs de stress potentiels et les variables modifiant la température telles que la manipulation des animaux pendant les procédures d’essai. À l’aide de minuteries, les mesures peuvent ensuite être enregistrées et collectées sur une période de temps sans interaction directe avec les animaux.

Pour minimiser davantage la perturbation des souris pendant les essais, cette méthode décrit l’assemblage et l’utilisation de risers en tuyauterie en PVC pour permettre à l’expérimentateur d’accéder au fond des cages domestiques pendant les essais. En utilisant les colonnes montantes en tandem avec le lecteur numérique, les mesures de température du membre transpondeur peuvent être effectuées sans aucune interaction animale après la mise en place du stimulus. À un coût minime, cette méthode peut être utilisée en conjonction avec des stimuli pharmacologiques et contextuels, ce qui la rend tout à fait accessible aux chercheurs. De plus, cette méthode peut être utilisée avec un nombre important de sujets (~16 souris ou ~12 rats) à la fois, ce qui permet de gagner du temps en augmentant le débit global de tout projet de recherche.

Cette méthode introduit dans ce mécanisme est conçu pour présenter des odeurs aux souris à l’aide de boules d’infuseur à thé en treillis en acier inoxydable, désormais appelées « boules de thé ». Bien que ces boules de thé soient idéales pour contenir n’importe quel matériau odorant, dans ces études, des serviettes qui ont servi de litière en cage pendant 2-3 semaines pour les furets, un prédateur naturel des souris et des rats, sont placées dans chaque boule de thé de traitement. Chaque serviette est coupée en carrés de 5 cm x 5 cm. Cette aliquote est également répétée avec des serviettes de contrôle inodores par ailleurs identiques. La présentation de ces odeurs sans barrière (c’est-à-dire boule de thé) a conduit les souris à déchiqueter les fibres dans leurs cages, augmentant ainsi l’activité physique. Ce comportement n’était pas aussi saillant chez les rats. Les boules de thé fournissent un boîtier ventilé à la serviette, donnant un accès complet à l’odeur tout en restant protégé pendant toute la durée de l’essai expérimental. Ces boules de thé peuvent être désinfectées conformément aux protocoles d’utilisation des animaux, préparées et introduites directement après la chirurgie pour commencer à habituer les animaux à la structure avec le stimulus de contrôle. Les souris peuvent alors vivre avec l’enrichissement supplémentaire, diminuant l’importance de la présentation de stimulus aigu.

L’accoutumance à la présence de la boule de thé n’est qu’un aspect de l’accoutumance qui est essentiel à cette méthode. Le protocole d’habituation décrit consiste également en une exposition répétée à la procédure d’essai pour normaliser l’environnement d’essai (c.-à-d. personnel, transport et déplacement vers le lieu d’essai, exposition à un stimulus). Cette accoutumance prolongée minimise les réponses nuancées des animaux et concentre les mesures sur les variables dépendantes souhaitées (p. ex., stimuli pharmacologiques ou contextuels). L’évaluation antérieure de ce protocole a identifié quatre essais comme le nombre minimum d’accoutumances nécessaires avant l’essai de température dans des cages domestiques chez le rat⁸. Si les tests sont séparés par de longues périodes (plus de 2-3 semaines), les animaux doivent être habitués à nouveau. Pour une accoutumance répétée, un minimum d’un à deux essais suffisent. Cependant, si les tests de température sont séparés par des périodes de temps plus longues, il peut être nécessaire de répéter d’autres essais.

Dans l’effort continu pour habituer les souris et les rats à la procédure d’essai, une période d’acclimatation avant la présentation du stimulus devrait être incluse dans chaque essai expérimental. Ce temps d’acclimatation est essentiel pour rééquilibrer la température et l’activité après avoir été déplacé vers le lieu d’essai. Les rongeurs ont tendance à avoir de fortes augmentations de température en raison de la translocation. L’acclimatation doit consister en un minimum de 1 h sans interaction de la part de l’expérimentateur le jour de l’essai avant tout ajout d’un agent pharmacologique ou de stimuli contextuels. Ceci est nécessaire chaque jour de test.

Dans les tests de température décrits dans la cage domestique, les souris ont la liberté de leur cage à domicile pour se déplacer en réponse au stimulus testé. Cela peut entraîner des changements variables dans l’activité, ce qui a une incidence sur la précision des lectures de température et, par conséquent, sur l’analyse des effets thermogéniques de la variable indépendante (p. ex., stimulus pharmacologique ou contextuel). En reconnaissance des changements potentiels de température dus au niveau d’activité, un protocole décrit ci-dessous l’utilisation de la température pendant la marche sur tapis roulant. La littérature publiée décrit l’utilisation réussie de cette procédure chez le rat, et elle est actuellement utilisée avec des souris 8,10,14,15. La marche sur tapis roulant maintient une vitesse d’activité constante pour le sujet testé. Pour cette étude, les tapis roulants sont strictement utilisés pour contrôler le niveau d’activité et, par conséquent, sont réglés à la vitesse la plus basse disponible sur le tapis roulant pour favoriser la marche pour les souris et un réglage tout aussi bas pour les rats.

La procédure suivante est décrite pour la mesure de la température du gastrocnémien unilatéral chez la souris et la présentation de l’odeur du prédateur. La conception peut être utilisée en conjonction avec des agents pharmacologiques et est transférable aux rats et à d’autres groupes musculaires squelettiques (quadriceps) chez la souris. Pour les rats, les transpondeurs peuvent être placés dans le gastrocnémien bilatéralement et dans le tissu adipeux brun. En raison des limites de taille et de distance, un seul transpondeur peut être utilisé par souris. Des modifications mineures (p. ex., la suppression de stimuli contextuels) peuvent être apportées pour évaluer les réponses thermogéniques aux agents pharmacologiques.

Protocol

Ces méthodes peuvent être appliquées à des modèles de rats et de souris et ont été réalisées avec l’approbation institutionnelle (Kent State University, IACUC Approval #359 et #340 CN 12-04). Avant la mise en œuvre du protocole, les animaux devraient être logés conformément au Guide sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. 1. Préparation du lecteur de transpondeur REMARQUE: Avant utilisation, le lecteur de t…

Representative Results

Des transpondeurs ont été implantés unilatéralement dans le gastrocnémien droit de dix souris de type sauvage (WT) âgées de 4 à 6 mois issues de la souche SF1-Cre (Tg(Nr5a1-cre)7Lowl/J, souche #012462, C57BL/6J et FVB; femelle N = 5; mâle N = 5). Après la récupération, les souris étaient habituées à une procédure d’analyse de la température de la cage domestique qui n’incluait pas de stimulus contextuel (p. ex. PO). Les mesures de température à l’aide d’une baguette transpondeur ont été enreg…

Discussion

Ce protocole de test de température fournit au domaine un moyen de mesurer directement la thermogenèse des muscles squelettiques. Ceci est essentiel alors que la recherche se penche sur l’identification des mécanismes sous-jacents à la thermogenèse musculaire³³. La méthode fournit deux protocoles rentables pour mesurer la thermogenèse des muscles squelettiques dans des conditions contextuelles et pharmacologiques. Ce protocole souligne l’importance de l’accoutumance et de l’acclimat…

Materials

1012M-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Mice, 2 Lanes w/ Shock	Columbus Instruments
1012R-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Rats, 2 Lanes w/ Shock	Columbus Instruments
1-1/4 in. Ratcheting PVC Cutter	BrassCraft
1 mL Syringes	Fisher Scientific	BD 309659
Betadine Swabs	Fisher Scientific	19-898-945
Booster Coil	BioMedic Data Systems		Transponder Accessory
Electric Clippers	Andis		40 Ultraedge Clipper Blade
Flexible Mirror Sheets	Amazon		Self Adhesive Non Glass Mirror Tiles
Forceps	Fisher Scientific	89259-940
Heating Pad
Induction Chamber (isoflurane)	Kent Scientific	VetFlo-0730	3.0 L Low Cost Chambers for Traditional Vaporizers
Ketoprophen	Med-Vet Intl.	RXKETO-50
Magnetic Strips	Amazon
Magnets	Amazon		DIYMAG Magnetic Hooks 40lbs
Needles	Med-Vet Intl.	26400
Neomycin/Polymixin/Bacitracin with Hydrocortisone Ophthalmic Ointment, 3.5 g	Med-Vet Intl.	RXNPB-HC
Oasis Absorbable Suture	Med-Vet Intl.	MV-H821-V
Predator (Ferret) Odor Towels	Marshall BioResources
PVC pipe
Reflex Wound Clip Remover	CellPoint Scientific
Reflex Wound Clip, 7 mm (mouse)	CellPoint Scientific
Reflex Wound Clip, 9 mm (rat)	CellPoint Scientific
Srerile Autoclip, 7 mm (mouse)	CellPoint Scientific		Wound Clip Applier (mouse)
Stainless Strainers Interval Seasonings Tea Infuser	Amazon
Sterile Autoclip, 9 mm (rat)	CellPoint Scientific		Wound Clip Applier (rat)
Sterile Saline	Med-Vet Intl.	RX0.9NACL-10
Surgical Scissors	Fisher Scientific	08-951-5
Surgical Sheets
Towels (Control/Habituation)	Amazon		100% Cotton Towels, white
Transponders	BioMedic Data Systems		Model: IPTT-300
Transponders Reader	BioMedic Data Systems		Model: DAS-8027-IUS/ DAS-7007R
Versaclean	Fisher Scientific	18-200-700	liquid detergent
Webcol Alcohol Preps	Covidien	22-246-073
Wedge pieces for PVC pipe