测量小鼠和大鼠的骨骼肌产热
Summary
小鼠和大鼠通过手术植入远程温度应答器，然后习惯于测试环境和程序。肌肉温度的变化是根据对家庭笼子中的药理学或上下文刺激或在规定的身体活动（即跑步机匀速行走）期间做出反应而测量的。
Abstract
骨骼肌产热为更好地了解代谢稳态和能量消耗的机制提供了一种潜在的途径。令人惊讶的是，很少有证据表明产热的神经、肌细胞和分子机制与肌肉温度的可测量变化直接联系起来。本文描述了一种利用温度应答器直接检索小鼠和大鼠骨骼肌温度测量值的方法。
远程应答器通过手术植入小鼠和大鼠的肌肉中，并给予动物恢复的时间。然后必须反复习惯小鼠和大鼠的测试环境和程序。测量肌肉温度的变化以响应家庭笼子中的药物或上下文刺激。肌肉温度也可以在规定的身体活动（即跑步机以恒定速度行走）期间测量，以排除活动的变化，作为这些刺激引起的肌肉温度变化的贡献因素。
该方法已成功用于阐明大脑、交感神经系统和骨骼肌水平肌肉产热控制的基础机制。提供了使用捕食者气味（PO;雪貂气味）作为上下文刺激和注射催产素（Oxt）作为药理学刺激的这种成功的证明，其中捕食者气味诱导肌肉产热，而Oxt抑制肌肉温度。因此，这些数据集显示了该方法在检测肌肉温度快速变化方面的功效。
Introduction
在代谢研究中，骨骼肌产热的检查是探测体重稳态的有前途的新途径。已发表的文献支持这样一种观点，即人体最大的器官系统之一 – 骨骼肌 – 的产热反应为增加能量消耗和其他代谢效应提供了途径，从而有效地重新平衡肥胖等疾病的系统1，2，3。如果肌肉可以被认为是产热器官，研究必须利用实用的方法来研究该器官内的产热变化。了解骨骼肌吸热影响的愿望以及该方法用于研究非颤抖肌肉产热的效用并不是代谢研究所特有的。包括进化4，比较生理学5和生态生理学6，7在内的学科在了解肌肉产热可能导致吸热的方式以及这种机制如何适应环境方面表现出既得利益。所提出的协议提供了解决这些问题所需的关键方法。
所提供的方法可用于评估肌肉温度的上下文和药理学刺激调节，包括提供捕食者气味（PO）以转移环境以复制捕食者威胁的独特技术。先前的报告已经证明PO能够迅速诱导肌肉产热的显着增加8。此外，药理刺激也可以改变肌肉温度。这已经在PO诱导的肌肉产热的背景下得到证实，其中使用纳多洛尔对外周β肾上腺素能受体的药理学阻断抑制了PO诱导肌肉产热的能力，而不会显着影响跑步机行走期间的收缩产热8。大鼠中黑皮质素受体激动剂的中枢给药也被用于辨别改变产热的大脑机制9，10。
这里提供的是对神经激素催产素（Oxt）改变小鼠肌肉产热能力的初步研究。与捕食者威胁类似，与同性同种的社交接触会增加体温，这种现象被称为社交热疗11。鉴于Oxt与社会行为的相关性12，有人推测Oxt是小鼠社会热疗的中介。事实上，催产素受体拮抗剂降低了小鼠的社交热疗11，缺乏Oxt的小鼠幼崽在体温调节的行为和生理方面表现出缺陷，包括产热13。鉴于 Harshaw 等人 （2021） 没有发现支持 β3 肾上腺素能受体依赖性棕色脂肪组织 （BAT） 产热与社交热疗的证据11，有人认为社交热疗可能是由 Oxt 诱导肌肉产热驱动的。
为了测量骨骼肌产热，以下协议使用在小鼠或大鼠8，10，14，15内与感兴趣的肌肉相邻的预编程IPTT-300应答器植入。这些应答器是玻璃封装的微芯片，使用相应的应答器读取器读取。几乎没有研究以这种能力使用这项技术，尽管研究表明需要这种方法提供的特异性16，17。先前的研究已经表明该方法的可靠性，以及与其他温度测试方法18或与手术方法（例如，插管19）结合使用的温度应答器的各种方式。然而，这种性质的研究依赖于不同的策略放置来测量整体体温20，21，22或指定的组织，如BAT 23，24，25。
不是从这些位置或在使用耳或直肠温度计26时测量温度，这里描述的方法为感兴趣的肌肉提供特异性。通过在感兴趣的肌肉附近直接植入应答器来靶向一个部位的能力对于探测肌肉产热更有效。除了表面红外测温法27，28或通过热电偶29进行皮肤温度测量之外，它还提供了一条新的途径。此外，通过这种方法提供的数据提供了一系列研究途径，避免了对大型，昂贵，高科技设备和软件的需求，例如红外热成像30，31，32。
该方法已成功用于单侧或双侧测量股四头肌和腓肠肌的温度。该方法与立体定位手术联合使用也有效14，15。在应答器肢体 ~7-10 cm 范围内，便携式应答器读取器 （DAS-8027/DAS-7007R） 用于扫描、测量和显示温度。这个距离对于先前的调查至关重要和有价值8，9，10，因为它最大限度地减少了潜在的压力源和温度变化变量，例如测试过程中的动物处理。使用计时器，可以在一段时间内记录和收集测量值，而无需与动物直接互动。
为了进一步减少测试过程中对小鼠的干扰，该方法描述了组装和使用由PVC管道制成的立管，以使实验者在测试期间能够进入家庭笼子的底部。将立管与数字阅读器配合使用，可以在放置刺激物后无需任何动物相互作用即可对应答器肢体进行温度测量。以最低的成本，这种方法可以与药理学和上下文刺激结合使用，使研究人员很容易获得。此外，该方法可以一次用于大量受试者（~16只小鼠或~12只大鼠），从而节省了增加任何研究项目整体通量的时间。
该方法介绍了一种使用不锈钢网状茶浸泡器球向小鼠呈现气味的精心制作的机制，从现在开始称为“茶球”。虽然这些茶球是含有任何气味物质的理想选择，但在这些研究中，在每个治疗茶球内放置了在 2-3 周内用作雪貂（小鼠和老鼠的天敌）笼内垫料的毛巾。每条毛巾被切成 5 厘米 x 5 厘米的正方形。这种等分试样也用其他相同的无味对照毛巾重复。在没有屏障（即茶球）的情况下呈现这些气味导致小鼠切碎笼内的纤维，增加体力活动。这种行为在大鼠中并不那么明显。茶球为毛巾提供了一个通风的外壳，可以完全接触气味，同时在整个实验试验中保持保护。这些茶球可以根据动物使用方案进行消毒，制备并在手术后直接引入，以开始使动物适应结构以及控制刺激。然后，小鼠可以忍受额外的富集，降低急性刺激呈现的显着性。
习惯茶球的存在只是习惯化的一个方面，对这种方法至关重要。所描述的习惯化方案还包括反复暴露于测试程序以使测试环境正常化（即，人员，运输和移动到测试位置，暴露于刺激）。这种扩展的习惯化最大限度地减少了动物的细微反应，并将测量重点放在所需的因变量（例如，药理学或上下文刺激）上。先前对该协议的评估已经确定了四项试验，作为大鼠在家笼内进行温度测试之前所需的最小习惯数量8.如果测试间隔很长时间（超过2-3周），则必须再次习惯动物。对于反复习惯，至少一到两次试验就足够了。但是，如果温度测试间隔更长的时间，则可能需要重复更多的试验。
在使小鼠和大鼠习惯测试程序的持续努力中，每个实验试验都应包括刺激呈现之前的适应期。该适应时间对于转移到测试位置后重新平衡温度和活动至关重要。啮齿动物往往由于易位而温度急剧升高。适应应包括至少1小时，在添加任何药物或上下文刺激之前，在测试当天没有来自实验者的相互作用。这是每天测试所必需的。
在概述的家笼温度测试中，小鼠有家笼的自由范围来漫游以响应测试的刺激。这可能导致活性的可变变化，影响温度读数的准确性，从而影响自变量（例如，药理学或上下文刺激）的产热效应分析。为了识别由于活动水平引起的温度的潜在变化，下面包括一个协议，描述在跑步机行走期间使用温度。已发表的文献描述了该程序在大鼠中的成功使用，目前正在8，10，14，15小鼠中使用。跑步机行走为测试对象保持恒定的活动速度。在这项研究中，跑步机被严格用于控制活动水平，因此，被设置为跑步机上的最低可用速度，以促进小鼠的行走和老鼠的类似低设置。
以下程序概述了小鼠单侧腓肠肌的温度测量和捕食者气味呈现。该设计可与药理学试剂结合使用，并可转移到小鼠的大鼠和其他骨骼肌群（即股四头肌）。对于大鼠，应答器可以放置在双侧腓肠肌和棕色脂肪组织中。由于尺寸和距离限制，每只鼠标只能使用一个应答器。可以进行微小的修改（例如，去除上下文刺激）以评估对药物的产热反应。
Protocol
Representative Results
Discussion
该温度测试协议为该领域提供了直接测量骨骼肌产热的途径。当研究深入研究确定肌肉产热的机制时，这一点至关重要33。该方法提供了两种具有成本效益的方案，用于在上下文和药理学条件下测量骨骼肌产热。该协议强调了这些程序中习惯化和适应的重要性。习惯化用于在不引入任何药理学或上下文刺激的情况下反复将测试对象引入测试程序;它是家用保持架和跑步机温度测试?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作由R15 DK097644和R15 DK108668支持。我们感谢Chaitanya K Gavini博士和Megan Rich博士之前的贡献，感谢Stanley Dannemiller博士确保我们遵守机构动物使用指南。特别感谢Tim Bartness博士为构建该方法及其相关研究提供了必要的基础研究。图1A、C、D和图2A是使用 Biorender.com 创建的。
Materials
| 1012M-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Mice, 2 Lanes w/ Shock | Columbus Instruments | ||
| 1012R-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Rats, 2 Lanes w/ Shock | Columbus Instruments | ||
| 1-1/4 in. Ratcheting PVC Cutter | BrassCraft | ||
| 1 mL Syringes | Fisher Scientific | BD 309659 | |
| Betadine Swabs | Fisher Scientific | 19-898-945 | |
| Booster Coil | BioMedic Data Systems | Transponder Accessory | |
| Electric Clippers | Andis | 40 Ultraedge Clipper Blade | |
| Flexible Mirror Sheets | Amazon | Self Adhesive Non Glass Mirror Tiles | |
| Forceps | Fisher Scientific | 89259-940 | |
| Heating Pad | |||
| Induction Chamber (isoflurane) | Kent Scientific | VetFlo-0730 | 3.0 L Low Cost Chambers for Traditional Vaporizers |
| Ketoprophen | Med-Vet Intl. | RXKETO-50 | |
| Magnetic Strips | Amazon | ||
| Magnets | Amazon | DIYMAG Magnetic Hooks 40lbs | |
| Needles | Med-Vet Intl. | 26400 | |
| Neomycin/Polymixin/Bacitracin with Hydrocortisone Ophthalmic Ointment, 3.5 g | Med-Vet Intl. | RXNPB-HC | |
| Oasis Absorbable Suture | Med-Vet Intl. | MV-H821-V | |
| Predator (Ferret) Odor Towels | Marshall BioResources | ||
| PVC pipe | |||
| Reflex Wound Clip Remover | CellPoint Scientific | ||
| Reflex Wound Clip, 7 mm (mouse) | CellPoint Scientific | ||
| Reflex Wound Clip, 9 mm (rat) | CellPoint Scientific | ||
| Srerile Autoclip, 7 mm (mouse) | CellPoint Scientific | Wound Clip Applier (mouse) | |
| Stainless Strainers Interval Seasonings Tea Infuser | Amazon | ||
| Sterile Autoclip, 9 mm (rat) | CellPoint Scientific | Wound Clip Applier (rat) | |
| Sterile Saline | Med-Vet Intl. | RX0.9NACL-10 | |
| Surgical Scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| Surgical Sheets | |||
| Towels (Control/Habituation) | Amazon | 100% Cotton Towels, white | |
| Transponders | BioMedic Data Systems | Model: IPTT-300 | |
| Transponders Reader | BioMedic Data Systems | Model: DAS-8027-IUS/ DAS-7007R | |
| Versaclean | Fisher Scientific | 18-200-700 | liquid detergent |
| Webcol Alcohol Preps | Covidien | 22-246-073 | |
| Wedge pieces for PVC pipe |
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