Polysomenreinigung aus Sojabohnen-Symbiose-Knötchen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur eukaryotischen Polysomenreinigung aus intakten Sojaknollen. Nach der Sequenzierung können Standardpipelines für die Genexpressionsanalyse verwendet werden, um differentiell exprimierte Gene auf Transkriptom- und Translatomebene zu identifizieren.

Abstract

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Strategie zur Untersuchung des eukaryotischen Translatoms des Sojabohnen (Glycine max) symbiotischen Knötchens bereitzustellen. Dieser Artikel beschreibt Methoden, die optimiert wurden, um pflanzliche Polyribosomen und die zugehörigen mRNAs zu isolieren, die mittels RNA-Sequenzierung analysiert werden sollen. Zunächst werden zytoplasmatische Lysate durch Homogenisierung unter Polysomen- und RNA-erhaltenden Bedingungen aus ganzen, gefrorenen Sojabohnenknollen gewonnen. Dann werden Lysate durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit entfernt, und 15% des Überstands werden für die Isolierung der Gesamt-RNA (TOTAL) verwendet. Das verbleibende gereinigte Lysat wird verwendet, um Polysomen durch Ultrazentrifugation durch ein zweilagiges Saccharosekissen (12% und 33,5%) zu isolieren. Polysom-assoziierte mRNA (PAR) wird nach der Resuspension aus polysomalen Pellets gereinigt. Sowohl TOTAL als auch PAR werden durch hochempfindliche Kapillarelektrophorese bewertet, um die Qualitätsstandards von Sequenzierungsbibliotheken für RNA-seq zu erfüllen. Als Beispiel für eine nachgeschaltete Anwendung können nach der Sequenzierung Standardpipelines für die Genexpressionsanalyse verwendet werden, um differentiell exprimierte Gene auf Transkriptom- und Translatomebene zu erhalten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode in Kombination mit RNA-seq die Untersuchung der translationalen Regulation eukaryotischer mRNAs in einem komplexen Gewebe wie dem symbiotischen Knötchen ermöglicht.

Introduction

Leguminosen wie Sojabohnen (Glycine max) können eine Symbiose mit bestimmten Bodenbakterien namens Rhizobien eingehen. Diese mutualistische Beziehung führt zur Bildung neuer Organe, der symbiotischen Knötchen, an den Pflanzenwurzeln. Die Knötchen sind die Pflanzenorgane, die die Bakterien beherbergen, und bestehen aus Wirtszellen, deren Zytoplasma mit einer spezialisierten Form von Rhizobien besiedelt ist, die Bakterioide genannt wird. Diese Bakterien katalysieren die Reduktion von Luftstickstoff (_N2) zu Ammoniak, das im Gegenzug für Kohlenhydrate ^1,2 auf die Pflanze übertragen wird.

Obwohl diese stickstofffixierende Symbiose eine der am besten untersuchten Pflanzen-Mikroben-Symbiosen ist, müssen noch viele Aspekte besser verstanden werden, wie zum Beispiel, wie Pflanzen, die verschiedenen abiotischen Stressbedingungen ausgesetzt sind, ihre Interaktion mit ihrem symbiotischen Partner modulieren und wie sich dies auf den Knötchenstoffwechsel auswirkt. Diese Prozesse könnten besser verstanden werden, indem das Knötchentranslatom (d.h. die Untergruppe der Boten-RNAs [mRNAs] aktiv translatiert) analysiert wird. Polyribosomen oder Polysomen sind Komplexe mehrerer Ribosomen, die mit mRNA assoziiert sind und häufig zur Untersuchung der Translation^{verwendet werden 3}. Die Polysomen-Profiling-Methode besteht aus der Analyse der mRNAs, die mit Polysomen assoziiert sind, und wurde erfolgreich eingesetzt, um die posttranskriptionellen Mechanismen zu untersuchen, die die Genexpression steuern, die in verschiedenen biologischen Prozessen auftritt ^4,5.

In der Vergangenheit konzentrierte sich die Genomexpressionsanalyse hauptsächlich auf die Bestimmung der mRNA-Häufigkeit 6,7,8,9. Es besteht jedoch ein Mangel an Korrelation zwischen Transkript- und Proteinspiegeln aufgrund der verschiedenen Stadien der posttranskriptionellen Regulation der Genexpression, insbesondere der Translation^10,11,12. Darüber hinaus wurde keine Abhängigkeit zwischen den Veränderungen auf der Ebene des Transkriptoms und denen, die auf der Ebene des Translatoms¹³ auftreten, beobachtet. Die direkte Analyse des Satzes von mRNAs, die übersetzt werden, ermöglicht eine genauere und vollständigere Messung der Zellgenexpression (deren Endpunkt die Proteinhäufigkeit ist) als die, die erhalten wird, wenn nur mRNA-Spiegel analysiert werden^14,15,16.

Dieses Protokoll beschreibt, wie pflanzliche Polysomen aus intakten Sojaknollen durch differentielle Zentrifugation durch ein zweischichtiges Saccharosekissen gereinigt werden (Abbildung 1). Da jedoch auch Bacteroid-abgeleitete Ribosomen in den Knötchen vorhanden sind, wird eine Mischung aus Ribosomen und RNA-Spezies gereinigt, obwohl die eukaryotischen die Hauptfraktion darstellen (90%-95%). Die anschließende RNA-Isolierung, Quantifizierung und Qualitätskontrolle wird ebenfalls beschrieben (Abbildung 1). Dieses Protokoll soll in Kombination mit RNA-seq experimentelle Ergebnisse zur translationalen Regulation eukaryotischer mRNAs in einem komplexen Gewebe wie dem symbiotischen Knötchen liefern.

Abbildung 1: Schematische Übersicht über die vorgeschlagene Methodik zur eukaryotischen Polysomenreinigung aus symbiotischen Knötchen. Das Schema gibt einen Überblick über die Schritte, die im Protokoll von (1) Pflanzenwachstum und (2) Knötchenernte bis (3) Herstellung der zytosolischen Extrakte, (3) Gewinnung von GESAMTPROBEN und (4) PAR-Proben und (5) RNA-Extraktion und Qualitätskontrolle befolgt werden. Abkürzungen: PEB = Polysomenextraktionspuffer; RB = Resuspensionspuffer; TOTAL = Gesamt-RNA; PAR = Polysom-assoziierte mRNA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Protocol

1. Pflanzenwachstum und Rhizobienimpfung Um die benötigten Knötchen zu erzeugen, säen Sie die Sojabohnensamen Ihrer Wahl in das ausgewählte Substrat in einer Wachstumskammer unter kontrollierten Bedingungen.HINWEIS: In diesem Protokoll wurden Samen in einer 0,5-l-Plastikflasche ausgesät, die mit einer Mischung aus Sand:Vermiculit (1:1) gefüllt war. Die Wachstumskammer wurde mit einer Tag/Nacht-Zyklustemperatur von 28 °C bzw. 20 °C bzw. einer Hell/Dunkel-Photoperiode von 16 h/8 h ein…

Representative Results

Die Quantitäts- und Qualitätsbewertung der mit dem oben genannten Verfahren gereinigten TOTAL- und PAR-Fraktionen ist entscheidend für den Erfolg, da für die meisten nachgelagerten Anwendungen, wie z. B. die RNA-Sequenzierung, qualitativ hochwertige Proben für die Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung von grundlegender Bedeutung sind. Darüber hinaus ermöglicht die Integrität der RNA-Moleküle die Erfassung einer Momentaufnahme des Genexpressionsprofils zum Zeitpunkt der Probenentnahme18</su…

Discussion

Die Untersuchung der Genexpressionsregulation auf translationaler Ebene ist entscheidend, um verschiedene biologische Prozesse besser zu verstehen, da der Endpunkt der Zellgenexpression die Proteinhäufigkeit^13,14 ist. Dies kann beurteilt werden, indem das Translatom des interessierenden Gewebes oder Organismus analysiert wird, für das die polysomale Fraktion gereinigt und die zugehörigen mRNAs analysiert werden sollen 3,4,34,35,36.^…

Materials

Plant growth and rhizobia inoculation
Orbital shaker	Daihan Scientific		Model SHO-1D
YEM-medium	Amresco	J850 (yeast extract) 0122 (mannitol)
Water deficit treatment
KNO3	Merck	221295
Porometer	Decagon Device		Model SC-1
Scalpel
Preparation of cytosolic extracts
Brij L23	Sigma-Aldrich	P1254
Centrifuge	Sigma		Model 2K15
Chloranphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698
DOC	Sigma-Aldrich	30970
DTT	Sigma-Aldrich	D9779
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Igepal CA 360	Sigma-Aldrich	I8896
KCl	Merck	1.04936
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
Plastic tissue grinder	Fisher Scientific	12649595
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
PTE	Sigma-Aldrich	P2393
Tris	Invitrogen	15504-020
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Weighing dish	Deltalab	1911103
Preparation of sucrose cushions
Sucrose	Invitrogen	15503022
SW 40 Ti rotor	Beckman-Coulter
Ultracentrifuge	Beckman-Coulter		Optima L-100K
Ultracentrifuge tubes	Beckman-Coulter	344059	13.2 mL tubes
RNA extraction and quality control
Agarose	Thermo scientific	R0492
Bioanalyzer	Agilent		Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay
Chloroform	DI	41191
Ethanol	Dorwil	UN1170
Isopropanol	Mallinckrodt	3032-06
Glycogen	Sigma	10814-010
TRIzol LS	Ambion	102960028
Miscellaneous
Falcon tubes 15 mL	Biologix	10-0152
Filter tips 10 µL	BioPointe Scientific	321-4050
Filter tips 1000 µL	BioPointe Scientific	361-1050
Filter tips 20 µL	BioPointe Scientific	341-4050
Filter tips 200 µL	Tarsons	528104
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Tarsons	500010-N
Microcentrifuge tubes 2.0 mL	Tarsons	500020-N
Sequencing company	Macrogen
Sterile 250 mL flask	Marienfeld	4110207