Este protocolo descreve um método de purificação de pórsome eucariótico a partir de nódulos de soja intactos. Após o sequenciamento, os dutos padrão para análise de expressão genética podem ser usados para identificar genes expressos diferencialmente nos níveis de transcriptome e translatome.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Purificação polissóbica de nódulos simbióticos de soja
Neste artigo
Resumo
Resumo
O objetivo deste protocolo é fornecer uma estratégia para estudar o traduzindo eucariótico do nódulo simbiótico de soja (Glycine max). Este artigo descreve métodos otimizados para isolar poliribos derivados de plantas e seus mRNAs associados a serem analisados usando sequenciamento de RNA. Em primeiro lugar, os licoplasatos citoplasmados são obtidos através da homogeneização em condições de preservação de poliso e RNA de nódulos inteiros e congelados de soja. Em seguida, os lysates são limpos por centrifugação de baixa velocidade, e 15% do supernante é usado para o isolamento total do RNA (TOTAL). O restante do lise limpo é usado para isolar pórsomeos por ultracentrifugação através de uma almofada de sacarose de duas camadas (12% e 33,5%). O mRNA (PAR) associado ao polissomo é purificado a partir de pelotas polissonais após a ressuspensão. Tanto total quanto PAR são avaliados por eletroforese capilar altamente sensível para atender aos padrões de qualidade das bibliotecas de sequenciamento para RNA-seq. Como exemplo de uma aplicação a jusante, após o sequenciamento, os pipelines padrão para análise de expressão genética podem ser usados para obter genes expressos diferencialmente nos níveis de transcriptome e tradução. Em resumo, este método, em combinação com o RNA-seq, permite o estudo da regulação translacional de mRNAs eucarióticas em um tecido complexo como o nódulo simbiótico.
Introdução
Plantas leguminous, como a soja (Glycine max), podem estabelecer simbiose com bactérias específicas do solo chamadas rizobia. Essa relação mutualista provoca a formação de novos órgãos, os nódulos simbióticos, nas raízes das plantas. Os nódulos são os órgãos vegetais que hospedam as bactérias e consistem em células hospedeiras cujo citoplasma é colonizado com uma forma especializada de rizobia chamada bacteroides. Esses bacteroides catalisam a redução do nitrogênio atmosférico (N2) em amônia, que é transferida para a planta em troca de carboidratos 1,2.
Embora es....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Crescimento vegetal e inoculação de rizobia
- Para gerar os nódulos necessários, semeie as sementes de soja escolhidas no substrato selecionado em uma câmara de crescimento em condições controladas.
NOTA: Neste protocolo, as sementes foram semeadas em uma garrafa plástica de 0,5 L recheada com uma mistura de areia:vermiculite (1:1). A câmara de crescimento foi definida com uma temperatura do ciclo dia/noite de 28 °C /20 °C, respectivamente, e um fotoperíodo de luz/escuridão de 16 h/8 h, respectivamente. A intensidade de radiação fotossintética ativa foi de 620 μmol·m−2·s−1. - Prepare com antecedência o líqui....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
A quantidade e a avaliação da qualidade das frações TOTAL e PAR purificadas com o procedimento acima mencionado é fundamental para determinar seu sucesso, uma vez que para a maioria das aplicações a jusante, como sequenciamento de RNA, amostras de alta qualidade são fundamentais para a preparação e sequenciamento da biblioteca. Além disso, a integridade das moléculas de RNA permite a captura de um instantâneo do perfil de expressão genética no momento da coleta da amostra18. Neste contexto, um núm.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Estudar a regulação da expressão genética no nível translacional é fundamental para compreender melhor diferentes processos biológicos, uma vez que o ponto final da expressão genética celular é a abundância deproteínas 13,14. Isso pode ser avaliado analisando o translatório do tecido ou organismo de interesse para o qual a fração polissômica deve ser purificada e seus mRNAs associados analisaram 3,4,34,35,36.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi financiada pela bolsa CSIC I+D 2020 nº 282, FVF 2017 grant No. 210 e PEDECIBA (María Martha Sainz).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| crescimento vegetal e inoculação de rizóbios | |||
| agitador orbital | Daihan Scientific | Modelo SHO-1D | |
| YEM-médio | Amresco | J850 (extrato de levedura) 0122 (manitol) | |
| tratamento do déficit hídrico | |||
| KNO3 | Merck | ||
| Dispositivo | Porometer | Modelo SC-1 | |
| Bisturi | |||
| < forte > Preparação de extratos citosólicos< / forte > | |||
| Brij L23 | Sigma-Aldrich | P1254 | |
| Centrífuga | Sigma | Modelo 2K15 | |
| Cloranfenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Cicloheximida | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DOC | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Igepal CA 360 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Moedor de tecido de plástico | Fisher Scientific | 12649595 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PTE | Sigma-Aldrich | P2393 | |
| Tris | Invitrogen | 15504-020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Prato de pesagem | Deltalab | 1911103 | |
| Preparação de almofadas de sacarose | |||
| Sacarose | Invitrogen | 15503022 | |
| SW 40 Ti rotor | Ultracentrífuga Beckman-Coulter | ||
| Ultracentrífuga | Beckman-Coulter | Optima L-100K | |
| 344059 | Tubos de 13,2 mL | ||
| < extração > RNA forte e controle de qualidade< / forte> | |||
| Agarose Thermo scientific | R0492 | ||
| Bioanalyzer | Agilent | Modelo 2100. Ensaio nano de RNA total eucarioto | |
| Clorofórmio | DI | 41191 | |
| Etanol | Dorwil | UN1170 | |
| Isopropanol | Mallinckrodt | 3032-06 | |
| Glicogênio | Sigma | 10814-010 | |
| TRIzol LS | Ambion | 102960028 | |
| Diversos | |||
| Tubos Falcon 15 mL | Biologix | 10-0152 | |
| Pontas de filtro 10 µ L | BioPointe Scientific | 321-4050 | |
| Pontas de filtro 1000 µ L | BioPointe Scientific | 361-1050 | |
| Pontas de filtro 20 µ L | BioPointe Scientific | 341-4050 | |
| Pontas de filtro 200 µ L | Tarsons | 528104 | |
| Tubos de microcentrífuga 1,5 mL | Tarsons | 500010-N | |
| Tubos de microcentrífuga 2,0 mL | Tarsons | 500020-N | |
| Empresa de sequenciamento | Macrogen | ||
| Estéril 250 mL frasco | Marienfeld | 4110207 |
Referências
- Limpens, E., et al. Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules. PLoS ONE. 8 (5), 64377(2013).
- Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legu....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
