माउस भ्रूण में प्रारंभिक कार्डियक पूर्वजों की लाइव इमेजिंग
Summary
हम माउस भ्रूण संस्कृति और इमेजिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो कार्डियक पूर्वज कोशिकाओं के 3 डी + टाइम इमेजिंग को सक्षम बनाता है। यह वीडियो-टूलकिट सफल लाइव इमेजिंग के लिए आवश्यक प्रमुख कौशल को संबोधित करता है अन्यथा पाठ-केवल प्रकाशनों से प्राप्त करना मुश्किल है।
Abstract
हृदय के विकास के पहले चरण सेल व्यवहार और भेदभाव में भारी परिवर्तन का संकेत देते हैं। जबकि निश्चित भ्रूण का विश्लेषण अभी भी स्नैपशॉट में विशिष्ट विकास चरणों का विस्तार से अध्ययन करने की अनुमति देता है, लाइव इमेजिंग भ्रूण को विकसित होने पर इमेजिंग करके गतिशील मोर्फोजेनेटिक घटनाओं, जैसे सेल माइग्रेशन, आकार परिवर्तन और भेदभाव को कैप्चर करता है। यह निश्चित विश्लेषण का पूरक है और भ्रूणजनन के दौरान अंगों के विकास की समझ का विस्तार करता है। इसके फायदों के बावजूद, लाइव इमेजिंग का उपयोग शायद ही कभी माउस मॉडल में इसकी तकनीकी चुनौतियों के कारण किया जाता है। प्रारंभिक माउस भ्रूण संवेदनशील होते हैं जब सुसंस्कृत पूर्व विवो होते हैं और कुशल हैंडलिंग की आवश्यकता होती है। माउस विकास अनुसंधान में लाइव इमेजिंग के व्यापक उपयोग की सुविधा के लिए, यह पेपर दो-फोटॉन लाइव माइक्रोस्कोपी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो माउस भ्रूण में दीर्घकालिक अधिग्रहण की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल के अलावा, भ्रूण हैंडलिंग और संस्कृति अनुकूलन पर सुझाव प्रदान किए जाते हैं। यह प्रारंभिक माउस ऑर्गेनोजेनेसिस में प्रमुख घटनाओं को समझने में मदद करेगा, कार्डियोवैस्कुलर पूर्वज जीव विज्ञान की समझ को बढ़ाएगा।
Introduction
पूरे भ्रूण में पोषक तत्वों को पंप करना शुरू करने के लिए भ्रूणजनन के दौरान हृदय जल्दी बनता है, जबकियह विकसित करना जारी रखता है। माउस भ्रूण में, गैस्ट्रुलेशन की शुरुआत के डेढ़ दिन बाद, एक अल्पविकसित हृदय अंग पूर्ववर्ती ध्रुव 2,3 पर इकट्ठा होता है। प्रारंभिक स्ट्रीक (ईएस) चरण तक, एपिब्लास्ट में कार्डियक पूर्वज आदिम लकीर के माध्यम से नवजात मेसोडर्मल परत 4,5,6 में प्रवेश करते हैं और पूर्ववर्ती ध्रुव पर पलायन करना शुरू करते हैं, जहां वे आदिम हृदय ट्यूब बनाने के लिए अंतर करते हैं। इस प्रक्रिया के दौरान, प्रारंभिक हृदय पूर्वज माइग्रेशन7 (चित्रा 1) के अलावा सेल पुनर्व्यवस्था, आकार परिवर्तन और भेदभाव से गुजरते हैं।
प्रारंभिक कार्डियक पूर्वजों ने एक साथ एक कार्यात्मक अंग को अलग करने और बनाने की उनकी उल्लेखनीय क्षमता के कारण लगभग एक सदी तक शोधकर्ताओं को आकर्षित किया है। पिछले दो दशकों में, क्लोनल विश्लेषण और सशर्त नॉकआउट मॉडल से पता चला है कि प्रारंभिक हृदय विकास एक अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया 8,9,10 में अलग-अलग सेल स्रोतों को फंसाता है। हालांकि, आदिम हृदय ट्यूब की 3 डी संरचना और इसके मोर्फोजेनेसिस की गतिशील प्रकृति अध्ययन करना चुनौतीपूर्ण बनाती है (चित्रा 1), और हम इसकी पूर्ण जटिलता11 को समझने से बहुत दूर हैं।
इन गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, लाइव इमेजिंग विधियां अब एक अभूतपूर्व विवरण 7,12,13,14 प्रदान करती हैं। माउस मॉडल में, लाइव दृष्टिकोण विकास ता्मक विषयों से पूछताछ करने के लिए महत्वपूर्ण रहे हैं जोस्थिर विश्लेषण 7,13,15 द्वारा संबोधित करना मुश्किल है। जबकि दीर्घकालिक पूर्व विवो संस्कृति और मजबूत माइक्रोस्कोप सेटअपतेजी से 16,17 आगे बढ़ रहे हैं, कुछ शोधकर्ताओं के पास लाइव भ्रूण की सफलतापूर्वक छवि बनाने की विशेषज्ञता है। यद्यपि पेपर-आधारित प्रकाशन लाइव इमेजिंग प्रयोगों को पुन: पेश करने के लिए पर्याप्त तकनीकी विवरण प्रदान करते हैं, कुछ कौशल और चालें दृश्य उदाहरणों या सहकर्मी-से-सहकर्मी सहायता के बिना समझना मुश्किल है। इस सीखने की प्रक्रिया में तेजी लाने और प्रयोगशालाओं के बीच लाइव इमेजिंग के उपयोग को फैलाने के लिए, हमने एक वीडियो प्रोटोकॉल (चित्रा 2) इकट्ठा किया जो गैस्ट्रुलेटेड माउस भ्रूण पर लाइव इमेजिंग करने के लिए आवश्यक कौशल इकट्ठा करता है।
चित्रा 1: माउस भ्रूण में कार्डियक पूर्वज कोशिकाओं का प्रारंभिक विभेदन गैस्ट्रुलेशन की शुरुआत से आदिम हृदय ट्यूब गठन से पहले के चरण तक। कार्डियक पूर्वज कोशिकाएं गैस्ट्रुलेशन की शुरुआत के तुरंत बाद मेसोडर्म में प्रवेश करती हैं, भ्रूण के विपरीत पक्ष में पलायन करती हैं। आरेखों के शीर्ष पर रूपात्मक और भ्रूण दिवस (ई) चरण लिखा गया है। डैश किए गए तीर गैस्ट्रुलेशन के दौरान आदिम हृदय ट्यूब पूर्वजों के प्रवास प्रक्षेपवक्र को दर्शाते हैं। इस आंकड़े को11 से अनुकूलित किया गया था। संक्षिप्तरूप: ईएस = प्रारंभिक स्ट्रीक; एमएस = मध्य स्ट्रीक; ईएचएफ = अर्ली हेड फोल्ड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: प्रारंभिक हृदय पूर्वजों की लाइव इमेजिंग के लिए वर्कफ़्लो आरेख. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रारंभिक हृदय पूर्वज एक आदिम हृदय ट्यूब में व्यवस्थित होते हैं जो अभी भी बनने के दौरान धड़कना शुरू कर देता है। यह समझना कि यह प्रक्रिया कैसे होती है, विशिष्ट मोर्फोजेनेटिक घटनाओं के लिए जन्मजात हृदय ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस पद्धति पर पिछले काम के लिए डॉ केंजो इवानोविच और भ्रूण माउंटिंग पर प्रारंभिक विशेषज्ञता प्रदान करने के लिए डॉ शिगेनोरी नोनाका (नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ नेचुरल साइंसेज, जापान) के समूह को स्वीकार करते हैं। इस अध्ययन को स्पेनिश मिनिस्टरियो डी सिएनसिया ई इनोवासियोन से ग्रांट पीजीसी 2018-096486-बी-आई00 और यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 कार्यक्रम से एमटी को ग्रांट एच 2020-एमएससीए-आईटीएन-2016-722427 और जेएनडी को फेडर एंडालुसिया 2014-2020 ऑपरेटिंग प्रोग्राम से अनुदान 1380918 द्वारा समर्थित किया गया था। एमएस को ला कैक्सा फाउंडेशन पीएचडी फैलोशिप (एलसीएफ / बीक्यू / डीई 18 / 11670014) और द कंपनी ऑफ बायोलॉजिस्ट ट्रैवलिंग फैलोशिप (डीईवीटीएफ 181145) द्वारा समर्थित किया गया था। सीएनआईसी स्पेनिश विज्ञान मंत्रालय और प्रोक्निक फाउंडेशन द्वारा समर्थित है।
Materials
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| Distilled water | |||
| DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
| Fluorobrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM for live-cell imaging |
| High-vacuum silicone grease | Dow Corning | Z273554-1EA | |
| Holder for wires | Perlen Pressen | pwb1 | |
| LSM 780 Upright microscope | Zeiss | ||
| MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm | Spectra-Physics | ||
| Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710) |
Zeiss | ||
| Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance | Zeiss | ||
| P1000 and P200 pipettes | |||
| Paraffin Oil | Nidacon | VNI0049 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | (the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin) |
| Petri dishes 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Pipette tips | |||
| Polymethyl methacrylate | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Set of 160 mm fines | RS PRO | 541-6933 | |
| Standard 1.0 mm glass capillaries | Anima Lab | 1B100F-3 | |
| Sterile 0.22 μm syringe filter | Corning | 431218 | |
| Sterile 5 mL syringe | Fisher Scientific | 15809152 | |
| Tungsten needles | |||
| Ultrasonic homogeniser (sonicator) | Bandelin | BASO_17021 |
Referências
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