Levande avbildning av tidiga hjärtprogenitorer i musembryot

Summary

Vi presenterar ett detaljerat protokoll för odling och avbildning av musembryon som möjliggör 3D + tidsavbildning av hjärtprogenitorceller. Denna videoverktygslåda tar upp de viktigaste färdigheterna som krävs för framgångsrik live-bildbehandling, annars svårt att förvärva från textpublikationer.

Abstract

De första stegen i hjärtutveckling innebär drastiska förändringar i cellbeteende och differentiering. Medan analys av fasta embryon gör det möjligt att studera i detalj specifika utvecklingsstadier i en stillbild, fångar levande avbildning dynamiska morfogenetiska händelser, såsom cellmigration, formförändringar och differentiering, genom att avbilda embryot när det utvecklas. Detta kompletterar fast analys och utvidgar förståelsen för hur organ utvecklas under embryogenesen. Trots sina fördelar används live-bildbehandling sällan i musmodeller på grund av dess tekniska utmaningar. Tidiga musembryon är känsliga när de odlas ex vivo och kräver effektiv hantering. För att underlätta en bredare användning av levande avbildning i musutvecklingsforskning presenterar detta dokument ett detaljerat protokoll för tvåfotons levande mikroskopi som möjliggör långsiktigt förvärv i musembryon. Utöver protokollet ges tips om embryohantering och odlingsoptimering. Detta kommer att hjälpa till att förstå viktiga händelser i tidig musorganogenes, vilket ökar förståelsen för kardiovaskulär stamfaderbiologi.

Introduction

Hjärtat bildas tidigt under embryogenesen för att börja pumpa näringsämnen till hela embryot, medan det fortsätter att utvecklas¹. I musembryon samlas ett och ett halvt dygn efter inledandet av gastrulationen ett rudimentärt hjärtorgan vid den främre polen ^2,3. Vid Early Streak (ES) -stadiet tränger hjärtprogenitorer i epiblasten genom den primitiva strimman till det begynnande mesodermala skiktet ^4,5,6 och börjar migrera till den främre polen^, där de differentierar för att bilda det primitiva hjärtröret. Under hela denna process genomgår tidiga hjärtprogenitorer cellomläggningar, formtransformationer och differentiering, förutom migration⁷ (figur 1).

Tidiga hjärtprogenitorer har lockat forskare i nästan ett sekel på grund av deras anmärkningsvärda förmåga att differentiera och bygga ett funktionellt organ samtidigt. Under de senaste två decennierna har klonal analys och villkorliga knockoutmodeller visat att tidig hjärtutveckling involverar distinkta cellkällor i en mycket dynamisk process ^8,9,10. Men 3D-strukturen hos det primitiva hjärtröret och den dynamiska karaktären av dess morfogenes gör det utmanande att studera (figur 1), och vi är långt ifrån att förstå dess fulla komplexitet¹¹.

För att studera dessa dynamiska cellulära processer erbjuder levande bildmetoder nu en oöverträffad detalj 7,12,13,14. I musmodellen har levande tillvägagångssätt varit nyckeln till att fråga utvecklingsämnen som är svåra att ta itu med genom statisk analys 7,13,15. Medan långsiktig ex vivo-kultur och robusta mikroskopuppsättningar går snabbt^{framåt 16,17,} har få forskare expertisen för att framgångsrikt avbilda levande embryon. Även om pappersbaserade publikationer ger tillräckligt med tekniska detaljer för att reproducera levande bildexperiment, är vissa färdigheter och tricks svåra att förstå utan visuella exempel eller peer-to-peer-hjälp. För att påskynda denna inlärningsprocess och sprida användningen av levande bildbehandling bland laboratorier monterade vi ett videoprotokoll (figur 2) som samlar de nödvändiga färdigheterna för att utföra live-avbildning på gastrulerande musembryon.

Figur 1: Tidig differentiering av hjärtprogenitorceller i musembryot från början av gastrulation till stadiet före primitiv hjärtrörsbildning. Hjärtstamceller tränger in i mesodermen strax efter gastrulationens början och migrerar till motsatt sida av embryot. Morfologiskt och embryonalt dag (E) stadium skrivs ovanpå diagrammen. Streckade pilar visar migrationsbanan för primitiva hjärtrörsprogenitorer under gastrulation. Denna siffra anpassades från¹¹. Förkortningar: ES = Early Streak; MS = Mellanstreck; EHF = Tidig huvudveckning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Arbetsflödesdiagram för levande avbildning av tidiga hjärtprogenitorer. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Protocol

Alla djurförsök godkändes av CNIC Animal Experimentation Ethics Committee, av Madridgemenskapen (referens PROEX 220/15) och överensstämde med EU-direktiv 2010/63EU och rekommendation 2007/526/EG om skydd av djur som används för försök och andra vetenskapliga ändamål, verkställda i spansk lag enligt Real Decreto 1201/2005. Detta protokoll inkluderar användning av två hanar från den fluorescerande transgena muslinjen som rapporterar NOTCH-aktivitet Tg(CBF:H2BVenus,+)<sup class="xr…

Representative Results

Vi använde protokollet för att visualisera NOTCH-signalaktivering hos tidiga hjärtprogenitorer som skulle differentiera till endotelceller under primitiv hjärtrörsmorfogenes. För det korsade vi vildtyp C57BL / 6-N-möss med Tg (CBF: H2BVenus, +) möss18 för att få embryon som rapporterar NOTCH-aktivitet genom gult fluorescerande protein Venus. Vid E7.5 är Venusfluorescens närvarande i hela neurala ektodermen, med några positiva kärnor vid splanchnic och extraembryonal mesoderm. Efter 4…

Discussion

Tidiga hjärtprogenitorer organiserar sig i ett primitivt hjärtrör som börjar slå medan det fortfarande bildas. Att förstå hur denna process sker är nyckeln till att fastställa det breda spektrumet av medfödda hjärtfel till specifika morfogenetiska händelser. För det erbjuder levande avbildning en möjlighet att studera normal och defekt embryonal utveckling med ökad tidsupplösning. Detta är särskilt användbart för att studera tidiga hjärtstamceller eftersom de snabbt övergår genom flera differentier…

Materials

#55 Forceps	Dumont	11295-51
35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter	Mattek	P35G-1.5-14-C
35 mm vise table	Grandado	SKU 8798771617573
50 mL tubes	BD Falcon	352070
Distilled water
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11966025	with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10438-026
Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+)	JAX
Fluorobrite DMEM	ThermoFisher	A1896701	DMEM for live-cell imaging
High-vacuum silicone grease	Dow Corning	Z273554-1EA
Holder for wires	Perlen Pressen	pwb1
LSM 780 Upright microscope	Zeiss
MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm	Spectra-Physics
Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710)	Zeiss
Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance	Zeiss
P1000 and P200 pipettes
Paraffin Oil	Nidacon	VNI0049
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063	(the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin)
Petri dishes 35 mm x 10 mm	BD Falcon	351008
Pipette tips
Polymethyl methacrylate			Reused from old laboratory equipment
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD	Janvier Labs	9979
Set of 160 mm fines	RS PRO	541-6933
Standard 1.0 mm glass capillaries	Anima Lab	1B100F-3
Sterile 0.22 μm syringe filter	Corning	431218
Sterile 5 mL syringe	Fisher Scientific	15809152
Tungsten needles
Ultrasonic homogeniser (sonicator)	Bandelin	BASO_17021