Många uppreglerade gener stimulerar tumörcellers migration och invasion, vilket leder till dålig prognos. Att avgöra vilka gener som reglerar tumörcellers migration och invasion är avgörande. Detta protokoll presenterar en metod för att undersöka effekterna av det ökade uttrycket av en gen på migration och invasion av tumörceller i realtid.
Tumörceller är mycket rörliga och invasiva och uppvisar förändrade genuttrycksmönster. Kunskap om hur förändringar i genuttryck reglerar tumörcellers migration och invasion är avgörande för att förstå mekanismerna för tumörcellers infiltration i närliggande friska vävnader och metastaser. Tidigare har det visats att genknockdown följt av impedansbaserad realtidsmätning av tumörcellers migration och invasion möjliggör identifiering av de gener som krävs för tumörcellers migration och invasion. På senare tid har mRNA-vaccinerna mot SARS-CoV-2 ökat intresset för att använda syntetiskt mRNA i terapeutiskt syfte. Här reviderades metoden med syntetiskt mRNA för att studera effekten av överuttryck av gener på tumörcellers migration och invasion. Denna studie visar att förhöjt genuttryck med syntetisk mRNA-transfektion följt av impedansbaserad realtidsmätning kan hjälpa till att identifiera de gener som stimulerar tumörcellsmigration och invasion. Denna metodartikel ger viktiga detaljer om procedurerna för att undersöka effekten av förändrat genuttryck på tumörcellsmigration och invasion.
Tumörcellernas rörlighet spelar en avgörande roll vid metastasering 1,2. Spridningen av tumörceller till närliggande och avlägsna friska vävnader försvårar cancerbehandling och bidrar till återfall 3,4. Därför är det viktigt att förstå mekanismerna för tumörcellernas rörlighet och utveckla relevanta terapeutiska strategier. Eftersom många tumörceller har förändrade genuttrycksprofiler är det viktigt att förstå vilka förändringar i genuttrycksprofilen som leder till förändrad tumörcellsrörlighet 5,6.
Flera analyser har utvecklats för att mäta cellmigration in vitro. Vissa analyser ger endast begränsad information på grund av att de endast tillåter mätningar vid specifika tidpunkter, medan andra erbjuder omfattande information om tumörcellernas rörlighet i realtid7. Även om många av dessa cellmotilitetsanalyser kan ge kvantitativa resultat vid en given tidpunkt eller slutpunkt, ger de inte tillräckligt detaljerad information om dynamiska förändringar i cellmigrationshastigheten under experimentperioden. Dessutom kan det vara svårt att undersöka potentiella förändringar i cellmigrationshastigheten beroende på experimentell design, celltyper och cellantal. Dessutom kan effekterna av okomplicerade behandlingar undersökas genom enkel kvantifiering av traditionella motilitetsanalyser, men mer sofistikerad kvantifiering kan krävas för att studera de komplexa effekterna av olika kombinerade behandlingar8.
Ett instrument för att övervaka den elektriska strömmen i en mikrotiterplattas botten täckt med mikroelektroderhar utvecklats. Vidhäftningen av celler till brunnens yta hindrar elektronflödet, och impedansen korrelerar med den kvantitativa och kvalitativa bindningen av cellerna. Närvaron av mikroelektroderna på brunnens botten möjliggör mätning av cellvidhäftning, spridning och proliferation. Närvaron av mikroelektroderna under ett mikroporöst membran i den övre kammaren möjliggör mätning av cellmigration och invasion i den nedre kammaren, med den övre kammaren belagd med extracellulära matrisproteiner (ECM) för att möjliggöra invasion10.
Tidigare har det visats att impedansbaserade realtidsmätningar av tumörcellers migration och invasion ger realtidsdata under hela experimentet, såväl som omedelbara jämförelser och kvantifieringar under olika experimentella förhållanden11. I den metodartikeln inducerades genknockdown för att testa vilken roll proteiner av intresse spelar för tumörcellers migration och invasion. Eftersom en fullskalig genknockdown-effekt under de testade experimentella förhållandena tog 3-4 dagar efter elektroporering med små interfererande RNA (siRNA)8, ompläterades cellerna efter elektroporeringen och återskördades 3 dagar senare för impedansbaserad realtidsmätning av tumörcellmigration och invasion.
CT10-regulator av kinas (Crk) och Crk-liknande (CrkL) är adapterproteiner som förmedlar protein-proteininteraktioner nedströms olika tillväxtfaktorreceptorkinasvägar och icke-receptortyrosinkinasvägar12. Förhöjda nivåer av Crk- och CrkL-proteiner bidrar till dålig prognos vid flera humana cancerformer, inklusive glioblastom13. Det är dock oklart hur förhöjda Crk- och CrkL-proteiner leder till en dålig prognos. Därför är det viktigt att definiera effekten av Crk och CrkL-överuttryck på tumörcellsfunktioner. Tidigare har en genknockdown-studie utförts för att visa att endogena nivåer av Crk- och CrkL-proteiner krävs för glioblastomcellmigration och invasion8. Här har ett modifierat analyssystem utvecklats för att ta itu med effekten av Crk- och CrkL-överuttryck på tumörcellsmigration och invasion.
På senare tid har in vitro-syntesen av mRNA och dess terapeutiska tillämpningar fått förnyad uppmärksamhet på grund av utvecklingen av mRNA-vaccinerna mot SARS-CoV-2 (granskad av Verbeke et al.14). Dessutom har anmärkningsvärda framsteg gjorts när det gäller att använda syntetiskt mRNA vid cancer och andra sjukdomar15,16. Elektroporering av celler är en effektiv metod för att leverera syntetiskt mRNA och inducera övergående genetisk modifiering (granskad av Campillo-Davo et al.17), och användningen av syntetiskt mRNA möjliggör snabbt och effektivt genuttryck i odödliga fibroblaster18. Denna metodartikel kombinerar genöveruttryck med hjälp av syntetiskt mRNA med cellanalyser i realtid för att studera tumörcellers migration och invasion. Det experimentella schemat som används för siRNA fungerar dock inte med syntetisk mRNA-transfektion, eftersom nivån av exogena proteiner ökar snabbt och minskar gradvis vid syntetisk mRNA-transfektion18. Därför har metoden modifierats för att utföra realtidsanalys av cellmigration och invasion direkt efter transfektionen utan att ytterligare odla cellerna.
Denna metodartikel visar att en kombination av impedansbaserade realtidsmätningar med transfektion av tumörceller med syntetiska mRNA ger en snabb och omfattande analys av effekterna av genuppreglering på tumörcellers migration och invasion. Denna metodartikel beskriver detaljerade procedurer för att mäta hur glioblastomcellernas migration och invasion påverkas av överuttryck av Crk och CrkL. Genom att undersöka de koncentrationsberoende effekterna av syntetiskt mRNA på tumörcellsmigration beskriver artikeln tydligt hur en ökning av proteinnivåerna stimulerar tumörcellmigration. Dessutom presenteras ett tillvägagångssätt för att variera koncentrationen av ECM-gelen för att bedöma effekterna av förändringar i genuttryck på tumörcellsinvasion.
Migration och invasion är viktiga egenskaper hos tumörceller. Att mäta tumörcellers rörlighet och förstå den underliggande mekanismen som styr tumörcellernas rörlighet ger viktiga insikter om terapeutiska interventioner 2,27. Flera metoder har utvecklats för att studera cellmigration7. Sårläkningsanalysen med repor eller odlingsinsatser är en enkel och ofta använd metod som ger kontrasterande bilder av spaltförslutning. Den …
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Medical Writing Center vid Children’s Mercy Kansas City för redigeringen av detta manuskript. Detta arbete stöddes av Natalie’s A.R.T. Foundation (till T.P.) och av ett MCA Partners Advisory Board-bidrag från Children’s Mercy Hospital (CMH) och University of Kansas Cancer Center (KUCC) (till T.P.).
AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 | Agarose gel imaging system |
α-Tubulin antibody | Sigma | T9026 | Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000) |
CIM-plate 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
Crk antibody | BD Biosciences | 610035 | Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500) |
CrkL antibody | Santa Cruz | sc-319 | Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500) |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Cell culture medium |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CV | Buffer used to wash cells |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | Culture medium supplement |
Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32210 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32211 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
Lithium chloride | Invitrogen | AM9480 | Used for RNA precipitation |
Matrigel matrix | Corning | 354234 | Extracellular matrix (ECM) gel |
MEGAscript T7 transcription kit | Invitrogen | AM1334 | Used for RNA synthesis |
Millennium RNA markers | Invitrogen | AM7150 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
Mini centrifuge | ISC BioExpress | C1301P-ISC | Used to spin down cells |
Mouse brain QUICK-Clone cDNA | TaKaRa | 637301 | Source of genes (inserts) for cloning |
NanoQuant | Tecan | M200PRO | Nucleic acid quantification system |
Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system1 |
Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
Neon transfection system 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Electroporation kit |
NorthernMax denaturing gel buffer | Invitrogen | AM8676 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
NorthernMax formaldehyde load dye | Invitrogen | AM8552 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
NorthernMax running buffer | Invitrogen | AM8671 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
Nuclease-free water | Teknova | W3331 | Used for various reactions during mRNA synthesis |
Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager for Western blot analysis | |
pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned |
pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | Source of the FLAG epitope tag |
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Sigma | P2069 | Used for DNA extraction |
PmeI | New England BioLabs | R0560L | Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis |
Poly(A) tailing kit | Invitrogen | AM1350 | Used for poly(A) tail reaction |
Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style) | Corning | 353003 | Used for culturing cells before transfection |
Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style) | Corning | 353001 | Used for culturing transfected cells |
Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | Used to remove protein in the reaction mixture |
Purifier Axiom Class II, Type C1 | Labconco Corporation | 304410001 | Biosafety cabinet for sterile handling of cells |
Resuspension Buffer R | ThermoFisher Scientific | A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information. | |
RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | RNA decontamination solution |
Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit | Cellscript | C-SCMT0625 | Used for capping reaction |
ScriptCap m7G capping system | Cellscript | C-SCCE0625 | Used for capping reaction |
Sodium dodecyl sulfate solution | Invitrogen | 15553-035 | Detergent used for the proteinase K reaction |
Sorvall Legend XT centrifuge | Thermo Scientific | 75004532 | Benchtop centrifuge to spin down cells |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Used for dissociation of cells |
U-118MG | ATCC | HTB15 | An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient |
Vinculin antibody | Sigma | V9131 | Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000) |
xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for real-time cell analysis |
1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?). |