Kvantitativ måling i realtid af tumorcellemigration og invasion efter syntetisk mRNA-transfektion

Summary

Mange opregulerede gener stimulerer tumorcellemigration og invasion, hvilket fører til dårlig prognose. Det er afgørende at bestemme, hvilke gener der regulerer tumorcellemigration og invasion. Denne protokol præsenterer en metode til at undersøge virkningerne af den øgede ekspression af et gen på migration og invasion af tumorceller i realtid.

Abstract

Tumorceller er meget bevægelige og invasive og viser ændrede genekspressionsmønstre. Viden om, hvordan ændringer i genekspression regulerer tumorcellemigration og invasion, er afgørende for at forstå mekanismerne for tumorcelleinfiltration i nærliggende sundt væv og metastase. Tidligere blev det påvist, at genknockdown efterfulgt af impedansbaseret realtidsmåling af tumorcellemigration og invasion muliggør identifikation af de gener, der kræves til tumorcellemigration og invasion. For nylig har mRNA-vaccinerne mod SARS-CoV-2 øget interessen for at bruge syntetisk mRNA til terapeutiske formål. Her blev metoden ved hjælp af syntetisk mRNA revideret for at studere effekten af genoverekspression på tumorcellemigration og invasion. Denne undersøgelse viser, at forhøjet genekspression med syntetisk mRNA-transfektion efterfulgt af impedansbaseret realtidsmåling kan hjælpe med at identificere de gener, der stimulerer tumorcellemigration og invasion. Dette metodepapir giver vigtige detaljer om procedurerne for undersøgelse af effekten af ændret genekspression på tumorcellemigration og invasion.

Introduction

Tumorcellemotilitet spiller en afgørende rolle i metastase ^1,2. Spredningen af tumorceller til nærliggende og fjerntliggende sunde væv gør kræftbehandling vanskelig og bidrager til gentagelse ^3,4. Derfor er det vigtigt at forstå mekanismerne for tumorcellemotilitet og udvikle relevante terapeutiske strategier. Da mange tumorceller har ændret genekspressionsprofiler, er det afgørende at forstå, hvilke ændringer i genekspressionsprofilen, der fører til ændret tumorcellemotilitet ^5,6.

Flere assays er blevet udviklet til at måle cellemigration in vitro. Nogle analyser giver kun begrænset information på grund af kun at tillade målinger på bestemte tidspunkter, mens andre tilbyder omfattende information om tumorcellemotilitet i realtid⁷. Selvom mange af disse cellemotilitetsanalyser kan give kvantitative resultater på et givet tidspunkt eller endepunktet, giver de ikke tilstrækkeligt detaljerede oplysninger om dynamiske ændringer i cellemigrationshastigheden i løbet af forsøgsperioden. Derudover kan det være vanskeligt at undersøge potentielle ændringer i cellemigrationshastigheden afhængigt af eksperimentelt design, celletyper og cellenumre. Desuden kan virkningerne af ukomplicerede behandlinger undersøges ved simpel kvantificering af traditionelle motilitetsassays, men mere sofistikeret kvantificering kan være nødvendig for at studere de komplekse virkninger af forskellige kombinerede behandlinger⁸.

Der er udviklet et instrument til overvågning af den elektriske strøm af en mikrotiterplade, der er godt bunddækket med mikroelektroder⁹. Vedhæftningen af celler til overfladen af brønden hindrer elektronstrømmen, og impedansen korrelerer med cellernes kvantitative og kvalitative binding. Tilstedeværelsen af mikroelektroderne på brøndbunden muliggør måling af celleadhæsion, spredning og proliferation. Tilstedeværelsen af mikroelektroderne under en mikroporøs membran i det øverste kammer muliggør måling af cellemigration og invasion i det nedre kammer, med det øverste kammer belagt med ekstracellulære matrixproteiner (ECM) for at muliggøre invasion¹⁰.

Tidligere blev det demonstreret, at impedansbaserede realtidsmålinger af tumorcellemigration og invasion giver realtidsdata under hele eksperimentet samt øjeblikkelige sammenligninger og kvantificeringer under forskellige eksperimentelle betingelser¹¹. I dette metodepapir blev genknockdown induceret for at teste rollen som proteiner af interesse i tumorcellemigration og invasion. Da en fuldblæst genknockdown-effekt under de testede eksperimentelle betingelser tog 3-4 dage efter elektroporation med små interfererende RNA’er (siRNA’er)⁸, blev cellerne genudgyldt efter elektroporationen og høstet igen 3 dage senere til impedansbaseret realtidsmåling af tumorcellemigration og invasion.

CT10-regulator af kinase (Crk) og Crk-lignende (CrkL) er adaptorproteiner, der medierer protein-proteininteraktioner nedstrøms for forskellige vækstfaktorreceptorkinaseveje og ikke-receptortyrosinkinaseveje¹². Forhøjede niveauer af Crk- og CrkL-proteiner bidrager til dårlig prognose i flere humane kræftformer, herunder glioblastom¹³. Det er imidlertid uklart, hvordan forhøjede Crk- og CrkL-proteiner fører til en dårlig prognose. Derfor er det vigtigt at definere effekten af Crk og CrkL overekspression på tumorcellefunktioner. Tidligere blev der udført en genknockdown-undersøgelse for at demonstrere, at endogene niveauer af Crk- og CrkL-proteiner er nødvendige for glioblastomcellemigration og invasion⁸. Her er der udviklet et modificeret analysesystem til at adressere effekten af Crk og CrkL overekspression på tumorcellemigration og invasion.

For nylig har in vitro-syntesen af mRNA og dets terapeutiske anvendelser tiltrukket fornyet opmærksomhed på grund af udviklingen af mRNA-vaccinerne mod SARS-CoV-2 (gennemgået af Verbeke et al.14). Derudover er der gjort bemærkelsesværdige fremskridt i brugen af syntetisk mRNA i kræft og andre sygdomme^15,16. Elektroporation af celler er en effektiv metode til at levere syntetisk mRNA og inducere forbigående genetisk modifikation (gennemgået af Campillo-Davo et al.17), og brugen af syntetisk mRNA muliggør hurtig og effektiv genekspression i udødeliggjorte fibroblaster ¹⁸. Dette metodepapir kombinerer genoverekspression ved hjælp af syntetisk mRNA med celleanalyser i realtid for at studere tumorcellemigration og invasion. Det eksperimentelle skema, der anvendes til siRNA’er, fungerer imidlertid ikke med syntetisk mRNA-transfektion, da niveauet af eksogene proteiner stiger hurtigt og falder gradvist ved syntetisk mRNA-transfektion¹⁸. Derfor er metoden blevet modificeret til at udføre realtidsanalyse af cellemigration og invasion lige efter transfektionen uden yderligere dyrkning af cellerne.

Dette metodepapir viser, at kombination af impedansbaserede realtidsmålinger med transfektion af tumorceller med syntetiske mRNA’er giver en hurtig og omfattende analyse af virkningerne af genopregulering på tumorcellemigration og invasion. Dette metodepapir beskriver detaljerede procedurer til måling af, hvordan migration og invasion af glioblastomceller påvirkes af overekspression af Crk og CrkL. Ved at undersøge de koncentrationsafhængige virkninger af syntetisk mRNA på tumorcellemigration beskriver papiret klart, hvordan en stigning i proteinniveauer stimulerer tumorcellemigration. Derudover præsenteres en tilgang til at variere koncentrationen af ECM-gelen for at vurdere virkningerne af ændringer i genekspression på tumorcelleinvasion.

Protocol

1. Syntese af mRNA BEMÆRK: Til mRNA-syntesen skal alle reagenser og udstyr behandles specielt for at inaktivere RNaserne før brug. Se materialefortegnelsen for detaljer om alle de materialer, instrumenter og reagenser, der anvendes i denne protokol. Linearisering af DNABEMÆRK: Mus-cDNA’er fra CrkI og CrkL blev klonet ind i pFLAG-CMV-5a-ekspressionsvektoren for at tilføje FLAG-epitopmærket ved C-terminalen og subklonet i pcDNA3.1/myc…

Representative Results

Crk- og CrkL-proteiner spiller vigtige roller i motiliteten af mange celletyper, herunder neuroner22, T-celler23, fibroblaster 18,19 og en række tumorceller13. Da Crk- og CrkL-proteiner er rapporteret at være forhøjet i glioblastom24,25,26, blev virkningerne af overekspression af CrkI, en splejsningsvariant af Crk,<sup class="xref"…

Discussion

Migration og invasion er vigtige træk ved tumorceller. Måling af tumorcellernes bevægelighed og forståelse af den underliggende mekanisme, der styrer tumorcellemotilitet, giver kritisk indsigt i terapeutiske interventioner ^2,27. Der er udviklet flere metoder til at studere cellemigration⁷. Sårhelingsanalysen ved hjælp af ridser eller kulturindsatser er en enkel og ofte anvendt metode, der giver kontrasterende billeder af hullukning. …

Materials

AlphaImager HP	ProteinSimple	92-13823-00	Agarose gel imaging system
α-Tubulin antibody	Sigma	T9026	Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000)
CIM-plate 16	Agilent Technologies, Inc	5665825001	Cell invasion and migration plates
Crk antibody	BD Biosciences	610035	Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)
CrkL antibody	Santa Cruz	sc-319	Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	ATCC	302002	Cell culture medium
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CV	Buffer used to wash cells
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30910.03	Culture medium supplement
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	Thermo Scientific	51030285	CO2 incubator
IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody	Li-Cor	926-32210	Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)
IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody	Li-Cor	926-32211	Secondary antibody for Western blot analysis  (dilution 1:10,000)
Lithium chloride	Invitrogen	AM9480	Used for RNA precipitation
Matrigel matrix	Corning	354234	Extracellular matrix (ECM) gel
MEGAscript T7 transcription kit	Invitrogen	AM1334	Used for RNA synthesis
Millennium RNA markers	Invitrogen	AM7150	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Mini centrifuge	ISC BioExpress	C1301P-ISC	Used to spin down cells
Mouse brain QUICK-Clone cDNA	TaKaRa	637301	Source of genes (inserts) for cloning
NanoQuant	Tecan	M200PRO	Nucleic acid quantification system
Neon electroporation system	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Electroporation system1
Neon transfection system 10 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK1025	Electroporation kit
Neon transfection system 100 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK10096	Electroporation kit
NorthernMax denaturing gel buffer	Invitrogen	AM8676	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax formaldehyde load dye	Invitrogen	AM8552	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax running buffer	Invitrogen	AM8671	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Nuclease-free water	Teknova	W3331	Used for various reactions during mRNA synthesis
Odyssey CLx Imager	Li-Cor		Imager for Western blot analysis
pcDNA3.1/myc-His	Invitrogen	V80020	The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned
pFLAG-CMV-5a	Millipore Sigma	E7523	Source of the FLAG epitope tag
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Sigma	P2069	Used for DNA extraction
PmeI	New England BioLabs	R0560L	Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis
Poly(A) tailing kit	Invitrogen	AM1350	Used for poly(A) tail reaction
Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style)	Corning	353003	Used for culturing cells before transfection
Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style)	Corning	353001	Used for culturing transfected cells
Proteinase K	Invitrogen	25530049	Used to remove protein in the reaction mixture
Purifier Axiom Class II, Type C1	Labconco Corporation	304410001	Biosafety cabinet for sterile handling of cells
Resuspension Buffer R	ThermoFisher Scientific		A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.
RNaseZap	Invitrogen	AM9780	RNA decontamination solution
Scepter	Millipore	C85360	Handheld automated cell counter
ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit	Cellscript	C-SCMT0625	Used for capping reaction
ScriptCap m7G capping system	Cellscript	C-SCCE0625	Used for capping reaction
Sodium dodecyl sulfate solution	Invitrogen	15553-035	Detergent used for the proteinase K reaction
Sorvall Legend XT centrifuge	Thermo Scientific	75004532	Benchtop centrifuge to spin down cells
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	Used for dissociation of cells
U-118MG	ATCC	HTB15	An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient
Vinculin antibody	Sigma	V9131	Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)
xCELLigence RTCA DP	Agilent Technologies, Inc	380601050	Instrument used for real-time cell analysis
1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).