Quantitative Echtzeitmessung der Tumorzellmigration und -invasion nach synthetischer mRNA-Transfektion

Summary

Viele hochregulierte Gene stimulieren die Migration und Invasion von Tumorzellen, was zu einer schlechten Prognose führt. Es ist entscheidend zu bestimmen, welche Gene die Migration und Invasion von Tumorzellen regulieren. Dieses Protokoll stellt eine Methode vor, um die Auswirkungen der erhöhten Expression eines Gens auf die Migration und Invasion von Tumorzellen in Echtzeit zu untersuchen.

Abstract

Tumorzellen sind hochbeweglich und invasiv und weisen veränderte Genexpressionsmuster auf. Das Wissen, wie Veränderungen in der Genexpression die Migration und Invasion von Tumorzellen regulieren, ist unerlässlich, um die Mechanismen der Infiltration von Tumorzellen in benachbarte gesunde Gewebe und der Metastasierung zu verstehen. Zuvor wurde gezeigt, dass der Gen-Knockdown gefolgt von der impedanzbasierten Echtzeitmessung der Tumorzellmigration und -invasion die Identifizierung der Gene ermöglicht, die für die Migration und Invasion von Tumorzellen erforderlich sind. In jüngster Zeit haben die mRNA-Impfstoffe gegen SARS-CoV-2 das Interesse an der Verwendung synthetischer mRNA zu therapeutischen Zwecken erhöht. Hier wurde die Methode mit synthetischer mRNA überarbeitet, um den Effekt der Genüberexpression auf die Migration und Invasion von Tumorzellen zu untersuchen. Diese Studie zeigt, dass eine erhöhte Genexpression mit synthetischer mRNA-Transfektion gefolgt von impedanzbasierter Echtzeitmessung dazu beitragen kann, die Gene zu identifizieren, die die Migration und Invasion von Tumorzellen stimulieren. Diese Methodenarbeit liefert wichtige Details zu den Verfahren zur Untersuchung des Einflusses einer veränderten Genexpression auf die Migration und Invasion von Tumorzellen.

Introduction

Die Motilität der Tumorzellen spielt eine entscheidende Rolle bei der Metastasierung ^1,2. Die Ausbreitung von Tumorzellen in benachbarte und entfernte gesunde Gewebe erschwert die Krebsbehandlung und trägt zum Rezidiv bei ^3,4. Daher ist es wichtig, die Mechanismen der Tumorzellmotilität zu verstehen und entsprechende therapeutische Strategien zu entwickeln. Da viele Tumorzellen veränderte Genexpressionsprofile aufweisen, ist es wichtig zu verstehen, welche Veränderungen im Genexpressionsprofil zu einer veränderten Tumorzellmotilität führen ^5,6.

Es wurden mehrere Assays entwickelt, um die Zellmigration in vitro zu messen. Einige Assays liefern nur begrenzte Informationen, da sie Messungen nur zu bestimmten Zeitpunkten ermöglichen, während andere umfassende Informationen über die Tumorzellmotilität in Echtzeit bieten⁷. Obwohl viele dieser Zellmotilitätsassays quantitative Ergebnisse zu einem bestimmten Zeitpunkt oder am Endpunkt liefern können, liefern sie keine ausreichend detaillierten Informationen über dynamische Änderungen der Zellmigrationsrate während des Versuchszeitraums. Darüber hinaus kann es schwierig sein, mögliche Änderungen der Zellmigrationsrate in Abhängigkeit vom Versuchsdesign, den Zelltypen und der Zellanzahl zu untersuchen. Darüber hinaus können die Auswirkungen unkomplizierter Behandlungen durch die einfache Quantifizierung herkömmlicher Motilitätsassays untersucht werden, aber eine ausgefeiltere Quantifizierung kann erforderlich sein, um die komplexen Auswirkungen verschiedener kombinierter Behandlungen zu untersuchen⁸.

Es wurde ein^{Instrument zur Überwachung} des elektrischen Stroms einer Mikrotiterplatte entwickelt, die mit Mikroelektroden bedeckt ist. Die Adhäsion der Zellen an der Oberfläche der Vertiefung behindert den Elektronenfluss, und die Impedanz korreliert mit der quantitativen und qualitativen Bindung der Zellen. Das Vorhandensein der Mikroelektroden am Boden der Vertiefung ermöglicht die Messung der Zelladhäsion, -ausbreitung und -proliferation. Das Vorhandensein der Mikroelektroden unter einer mikroporösen Membran der oberen Kammer ermöglicht die Messung der Zellmigration und -invasion in die untere Kammer, wobei die obere Kammer mit extrazellulären Matrixproteinen (ECM) beschichtet ist, um eine Invasion zu ermöglichen¹⁰.

Zuvor wurde gezeigt, dass impedanzbasierte Echtzeitmessungen der Tumorzellmigration und -invasion während des gesamten Experiments Echtzeitdaten sowie sofortige Vergleiche und Quantifizierungen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen liefern¹¹. In dieser Methodenarbeit wurde der Gen-Knockdown induziert, um die Rolle von Proteinen von Interesse bei der Migration und Invasion von Tumorzellen zu testen. Da ein ausgewachsener Gen-Knockdown-Effekt unter den getesteten experimentellen Bedingungen 3-4 Tage nach der Elektroporation mit kleinen interferierenden RNAs (siRNAs)⁸ einsetzte, wurden die Zellen nach der Elektroporation neu plattiert und 3 Tage später für die impedanzbasierte Echtzeitmessung der Tumorzellmigration und -invasion erneut geerntet.

CT10-Regulator der Kinase (Crk) und Crk-like (CrkL) sind Adapterproteine, die Protein-Protein-Wechselwirkungen stromabwärts verschiedener Wachstumsfaktor-Rezeptorkinase-Signalwege und Nichtrezeptor-Tyrosinkinase-Signalwege vermitteln¹². Erhöhte Spiegel von Crk und CrkL-Proteinen tragen zu einer schlechten Prognose bei mehreren menschlichen Krebsarten, einschließlich des Glioblastoms¹³, bei. Unklar ist allerdings, wie erhöhte Crk- und CrkL-Proteine zu einer schlechten Prognose führen. Daher ist es wichtig, den Effekt der Crk- und CrkL-Überexpression auf die Tumorzellfunktionen zu definieren. Zuvor wurde eine Gen-Knockdown-Studie durchgeführt, um zu zeigen, dass endogene Konzentrationen von Crk- und CrkL-Proteinen für die Migration und Invasion von Glioblastomzellen erforderlich sind⁸. Hier wurde ein modifiziertes Assay-System entwickelt, um den Effekt der Crk- und CrkL-Überexpression auf die Migration und Invasion von Tumorzellen zu untersuchen.

In jüngster Zeit haben die In-vitro-Synthese von mRNA und ihre therapeutischen Anwendungen durch die Entwicklung der mRNA-Impfstoffe gegen SARS-CoV-2 (überprüft von Verbeke et ^al.14) erneut Aufmerksamkeit erregt. Darüber hinaus wurden bemerkenswerte Fortschritte bei der Verwendung synthetischer mRNA bei Krebs und anderen Krankheiten erzielt^15,16. Die Elektroporation von Zellen ist eine effektive Methode, um synthetische mRNA zu verabreichen und eine vorübergehende genetische Modifikation zu induzieren (überprüft von Campillo-Davo et al.17), und die Verwendung synthetischer mRNA ermöglicht eine schnelle und effiziente Genexpression in immortalisierten Fibroblasten ¹⁸. Diese Methodenarbeit kombiniert die Überexpression von Genen unter Verwendung synthetischer mRNA mit Echtzeit-Zellanalysen, um die Migration und Invasion von Tumorzellen zu untersuchen. Das experimentelle Schema, das für siRNAs verwendet wird, funktioniert jedoch nicht mit synthetischer mRNA-Transfektion, da der Gehalt an exogenen Proteinen schnell ansteigt und bei synthetischer mRNA-Transfektion allmählich abnimmt¹⁸. Daher wurde die Methode modifiziert, um die Echtzeitanalyse der Zellmigration und -invasion direkt nach der Transfektion durchzuführen, ohne die Zellen zusätzlich zu kultivieren.

Diese Methodenarbeit zeigt, dass die Kombination von impedanzbasierten Echtzeitmessungen mit der Transfektion von Tumorzellen mit synthetischen mRNAs eine schnelle und umfassende Analyse der Auswirkungen der Genhochregulierung auf die Migration und Invasion von Tumorzellen ermöglicht. In diesem Methodenpapier werden detaillierte Verfahren beschrieben, um zu messen, wie die Migration und Invasion von Glioblastomzellen durch die Überexpression von Crk und CrkL beeinflusst wird. Durch die Untersuchung der konzentrationsabhängigen Effekte von synthetischer mRNA auf die Tumorzellmigration wird in der Arbeit klar beschrieben, wie ein Anstieg des Proteinspiegels die Migration von Tumorzellen stimuliert. Darüber hinaus wird ein Ansatz zur Variation der Konzentration des ECM-Gels vorgestellt, um die Auswirkungen von Veränderungen der Genexpression auf die Tumorzellinvasion zu untersuchen.

Protocol

1. Synthese von mRNA HINWEIS: Für die mRNA-Synthese müssen alle Reagenzien und Geräte speziell behandelt werden, um die RNasen vor der Verwendung zu inaktivieren. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Instrumenten und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden. Linearisierung der DNAANMERKUNG: Maus-cDNAs von CrkI und CrkL wurden in den pFLAG-CMV-5a-Expressionsvektor kloniert, um den FLAG-Epitop-Tag …

Representative Results

Crk- und CrkL-Proteine spielen eine wichtige Rolle bei der Motilität vieler Zelltypen, darunter Neuronen22, T-Zellen23, Fibroblasten 18,19 und eine Vielzahl von Tumorzellen13. Da Crk- und CrkL-Proteine im Glioblastom24,25,26 erhöht sind, wurden in dieser Arbeit die Auswirkungen der Überexpression von CrkI, einer Spleißvariante von Crk,<…

Discussion

Migration und Invasion sind wichtige Merkmale von Tumorzellen. Die Messung der Motilität von Tumorzellen und das Verständnis des zugrunde liegenden Mechanismus, der die Tumorzellmotilität steuert, liefern wichtige Einblicke in therapeutische Interventionen ^2,27. Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um die Zellmigration zu untersuchen⁷. Der Wundheilungstest mit Kratzern oder Kultureinsätzen ist eine einfache und häufig verwendete Met…

Materials

AlphaImager HP	ProteinSimple	92-13823-00	Agarose gel imaging system
α-Tubulin antibody	Sigma	T9026	Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000)
CIM-plate 16	Agilent Technologies, Inc	5665825001	Cell invasion and migration plates
Crk antibody	BD Biosciences	610035	Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)
CrkL antibody	Santa Cruz	sc-319	Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	ATCC	302002	Cell culture medium
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CV	Buffer used to wash cells
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30910.03	Culture medium supplement
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	Thermo Scientific	51030285	CO2 incubator
IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody	Li-Cor	926-32210	Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)
IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody	Li-Cor	926-32211	Secondary antibody for Western blot analysis  (dilution 1:10,000)
Lithium chloride	Invitrogen	AM9480	Used for RNA precipitation
Matrigel matrix	Corning	354234	Extracellular matrix (ECM) gel
MEGAscript T7 transcription kit	Invitrogen	AM1334	Used for RNA synthesis
Millennium RNA markers	Invitrogen	AM7150	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Mini centrifuge	ISC BioExpress	C1301P-ISC	Used to spin down cells
Mouse brain QUICK-Clone cDNA	TaKaRa	637301	Source of genes (inserts) for cloning
NanoQuant	Tecan	M200PRO	Nucleic acid quantification system
Neon electroporation system	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Electroporation system1
Neon transfection system 10 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK1025	Electroporation kit
Neon transfection system 100 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK10096	Electroporation kit
NorthernMax denaturing gel buffer	Invitrogen	AM8676	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax formaldehyde load dye	Invitrogen	AM8552	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax running buffer	Invitrogen	AM8671	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Nuclease-free water	Teknova	W3331	Used for various reactions during mRNA synthesis
Odyssey CLx Imager	Li-Cor		Imager for Western blot analysis
pcDNA3.1/myc-His	Invitrogen	V80020	The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned
pFLAG-CMV-5a	Millipore Sigma	E7523	Source of the FLAG epitope tag
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Sigma	P2069	Used for DNA extraction
PmeI	New England BioLabs	R0560L	Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis
Poly(A) tailing kit	Invitrogen	AM1350	Used for poly(A) tail reaction
Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style)	Corning	353003	Used for culturing cells before transfection
Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style)	Corning	353001	Used for culturing transfected cells
Proteinase K	Invitrogen	25530049	Used to remove protein in the reaction mixture
Purifier Axiom Class II, Type C1	Labconco Corporation	304410001	Biosafety cabinet for sterile handling of cells
Resuspension Buffer R	ThermoFisher Scientific		A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.
RNaseZap	Invitrogen	AM9780	RNA decontamination solution
Scepter	Millipore	C85360	Handheld automated cell counter
ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit	Cellscript	C-SCMT0625	Used for capping reaction
ScriptCap m7G capping system	Cellscript	C-SCCE0625	Used for capping reaction
Sodium dodecyl sulfate solution	Invitrogen	15553-035	Detergent used for the proteinase K reaction
Sorvall Legend XT centrifuge	Thermo Scientific	75004532	Benchtop centrifuge to spin down cells
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	Used for dissociation of cells
U-118MG	ATCC	HTB15	An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient
Vinculin antibody	Sigma	V9131	Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)
xCELLigence RTCA DP	Agilent Technologies, Inc	380601050	Instrument used for real-time cell analysis
1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).