कई अनियमित जीन ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण को उत्तेजित करते हैं, जिससे खराब रोग का निदान होता है। यह निर्धारित करना कि कौन से जीन ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण को नियंत्रित करते हैं, महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल वास्तविक समय में ट्यूमर कोशिकाओं के प्रवास और आक्रमण पर जीन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति के प्रभावों की जांच के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है।
ट्यूमर कोशिकाएं अत्यधिक गतिशील और आक्रामक होती हैं और परिवर्तित जीन अभिव्यक्ति पैटर्न प्रदर्शित करती हैं। जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण को कैसे नियंत्रित करते हैं, इसका ज्ञान पड़ोसी स्वस्थ ऊतकों और मेटास्टेसिस में ट्यूमर सेल घुसपैठ के तंत्र को समझने के लिए आवश्यक है। पहले, यह प्रदर्शित किया गया था कि ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण के प्रतिबाधा-आधारित वास्तविक समय माप के बाद जीन वध ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण के लिए आवश्यक जीन की पहचान को सक्षम बनाता है। हाल ही में, सार्स-सीओवी-2 के खिलाफ एमआरएनए टीकों ने चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए सिंथेटिक एमआरएनए का उपयोग करने में रुचि बढ़ाई है। यहां, सिंथेटिक एमआरएनए का उपयोग करने वाली विधि को ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण पर जीन ओवरएक्प्रेशन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया गया था। यह अध्ययन दर्शाता है कि प्रतिबाधा-आधारित वास्तविक समय माप के बाद सिंथेटिक एमआरएनए अभिकर्मक के साथ ऊंचा जीन अभिव्यक्ति उन जीनों की पहचान करने में मदद कर सकती है जो ट्यूमर सेल प्रवास और आक्रमण को उत्तेजित करते हैं। यह विधि पत्र ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण पर परिवर्तित जीन अभिव्यक्ति के प्रभाव की जांच के लिए प्रक्रियाओं पर महत्वपूर्ण विवरण प्रदान करता है।
ट्यूमर सेल गतिशीलता मेटास्टेसिस 1,2 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। पड़ोसी और दूरस्थ स्वस्थ ऊतकों में ट्यूमर कोशिकाओं का प्रसार कैंसर के उपचार को मुश्किल बनाता है और पुनरावृत्ति में योगदान देताहै 3,4. इसलिए, ट्यूमर सेल गतिशीलता के तंत्र को समझना और प्रासंगिक चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करना आवश्यक है। चूंकि कई ट्यूमर कोशिकाओं ने जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल को बदल दिया है, इसलिए यह समझना महत्वपूर्ण है कि जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में कौन से परिवर्तन ट्यूमर सेल गतिशीलता 5,6 को बदल देते हैं।
विट्रो में सेल माइग्रेशन को मापने के लिए कई परख विकसित किए गए हैं। कुछ परख केवल विशिष्ट समय बिंदुओं पर माप की अनुमति देने के कारण सीमित जानकारी प्रदान करते हैं, जबकि अन्य वास्तविक समय7 में ट्यूमर सेल गतिशीलता पर व्यापक जानकारी प्रदान करते हैं। यद्यपि इनमें से कई सेल गतिशीलता परख किसी दिए गए समय या समापन बिंदु पर मात्रात्मक परिणाम प्रदान कर सकते हैं, वे प्रयोगात्मक अवधि में सेल माइग्रेशन की दर में गतिशील परिवर्तनों पर पर्याप्त विस्तृत जानकारी प्रदान करने में विफल रहते हैं। इसके अलावा, प्रयोगात्मक डिजाइन, सेल प्रकार और सेल संख्या के आधार पर सेल माइग्रेशन दर में संभावित परिवर्तनों की जांच करना मुश्किल हो सकता है। इसके अलावा, पारंपरिक गतिशीलता परख ों के सरल परिमाणीकरण द्वारा सरल उपचार के प्रभावों की जांच की जा सकती है, लेकिन विभिन्नसंयुक्त उपचारों के जटिल प्रभावों का अध्ययन करने के लिए अधिक परिष्कृत परिमाणीकरण की आवश्यकता हो सकती है।
माइक्रोइलेक्ट्रोड से ढकी माइक्रोटिटर प्लेट के विद्युत प्रवाह की निगरानी के लिए एकउपकरण विकसित किया गया है। कुएं की सतह पर कोशिकाओं का आसंजन इलेक्ट्रॉन प्रवाह को बाधित करता है, और प्रतिबाधा कोशिकाओं के मात्रात्मक और गुणात्मक बंधन से संबंधित है। कुएं के तल पर माइक्रोइलेक्ट्रोड की उपस्थिति सेल आसंजन, प्रसार और प्रसार के माप की अनुमति देती है। ऊपरी कक्ष की एक माइक्रोपोरस झिल्ली के नीचे माइक्रोइलेक्ट्रोड की उपस्थिति निचले कक्ष में सेल माइग्रेशन और आक्रमण के माप की अनुमति देती है, जिसमें ऊपरी कक्ष को बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन के साथ लेपित किया जाता है ताकि आक्रमण10 की अनुमति मिल सके।
पहले, यह प्रदर्शित किया गया था कि ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण के प्रतिबाधा-आधारित वास्तविक समय माप पूरे प्रयोग के दौरान वास्तविक समय डेटा प्रदान करते हैं, साथ ही विभिन्नप्रयोगात्मक स्थितियों के तहत तत्काल तुलना और परिमाणीकरण भी प्रदान करते हैं। उस विधि पत्र में, जीन वध को ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण में रुचि के प्रोटीन की भूमिका का परीक्षण करने के लिए प्रेरित किया गया था। चूंकि परीक्षण की गई प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत एक पूर्ण विकसित जीन वध प्रभाव में छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए (एसआईआरएनए) 8 के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद 3-4 दिन लगते हैं, इसलिए इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद कोशिकाओं को फिर से चढ़ाया गया और ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण के प्रतिबाधा-आधारित वास्तविक समय माप के लिए 3 दिन बाद फिर से काटा गया।
काइनेज (सीआरके) और सीआरके-जैसे (सीआरकेएल) के सीटी 10 नियामक एडाप्टर प्रोटीन हैं जो विभिन्न विकास कारक रिसेप्टर किनेज मार्गों और नॉनसेप्टर टायरोसिन किनेजमार्गों के डाउनस्ट्रीम प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को मध्यस्थ करते हैं। सीआरके और सीआरकेएल प्रोटीन के ऊंचे स्तर ग्लियोब्लास्टोमा13 सहित कई मानव कैंसर में खराब रोग का निदान करने में योगदान करते हैं। हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि कैसे ऊंचा सीआरके और सीआरकेएल प्रोटीन एक खराब रोग का कारण बनता है। इसलिए, ट्यूमर सेल कार्यों पर सीआरके और सीआरकेएल ओवरएक्प्रेशन के प्रभाव को परिभाषित करना महत्वपूर्ण है। इससे पहले, एक जीन वध अध्ययन यह प्रदर्शित करने के लिए किया गया था कि ग्लियोब्लास्टोमा सेल माइग्रेशन और आक्रमण8 के लिए सीआरके और सीआरकेएल प्रोटीन के अंतर्जात स्तर की आवश्यकता होती है। यहां, ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण पर सीआरके और सीआरकेएल ओवरएक्प्रेशन के प्रभाव को संबोधित करने के लिए एक संशोधित परख प्रणाली विकसित की गई है।
हाल ही में, एमआरएनए के इन विट्रो संश्लेषण और इसके चिकित्सीय अनुप्रयोगों ने सार्स-सीओवी-2 के खिलाफ एमआरएनए टीकों के विकास के कारण नए सिरे से ध्यान आकर्षित किया है (वर्बेके एट अल.14 द्वारा समीक्षा की गई)। इसके अलावा, कैंसर औरअन्य बीमारियों में सिंथेटिक एमआरएनए का उपयोग करने में उल्लेखनीय प्रगति हुई है। कोशिकाओं का विद्युतीकरण सिंथेटिक एमआरएनए देने और क्षणिक आनुवंशिक संशोधन को प्रेरित करने के लिए एक प्रभावी तरीका है (कैम्पिलो-डेवो एट अल .17 द्वारा समीक्षा की गई), और सिंथेटिक एमआरएनए का उपयोग अमर फाइब्रोब्लास्ट18 में तेजी से और कुशल जीन अभिव्यक्ति को सक्षम बनाता है। यह विधि पेपर ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण का अध्ययन करने के लिए वास्तविक समय सेल विश्लेषण के साथ सिंथेटिक एमआरएनए का उपयोग करके जीन ओवरएक्प्रेशन को जोड़ती है। हालांकि, एसआईआरएनए के लिए उपयोग की जाने वाली प्रयोगात्मक योजना सिंथेटिक एमआरएनए अभिकर्मक के साथ काम नहीं करती है, क्योंकि बहिर्जात प्रोटीन का स्तर तेजी से बढ़ता है और सिंथेटिक एमआरएनए अभिकर्मक18 पर धीरे-धीरे घटता है। इसलिए, कोशिकाओं को अतिरिक्त रूप से संवर्धन किए बिना अभिकर्मक के ठीक बाद सेल माइग्रेशन और आक्रमण का वास्तविक समय विश्लेषण करने के लिए विधि को संशोधित किया गया है।
यह विधि पत्र दर्शाता है कि सिंथेटिक एमआरएनए के साथ ट्यूमर कोशिकाओं के अभिकर्मक के साथ प्रतिबाधा-आधारित वास्तविक समय माप का संयोजन ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण पर जीन अपरेगुलेशन के प्रभावों का तेजी से और व्यापक विश्लेषण प्रदान करता है। यह विधि पत्र यह मापने के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं का वर्णन करता है कि कैसे ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं का प्रवास और आक्रमण सीआरके और सीआरकेएल के अतिवृद्धि से प्रभावित होता है। ट्यूमर सेल माइग्रेशन पर सिंथेटिक एमआरएनए के एकाग्रता-निर्भर प्रभावों की जांच करके, पेपर स्पष्ट रूप से वर्णन करता है कि प्रोटीन के स्तर में वृद्धि ट्यूमर सेल माइग्रेशन को कैसे उत्तेजित करती है। इसके अलावा, ट्यूमर सेल आक्रमण पर जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के प्रभावों का आकलन करने के लिए ईसीएम जेल की एकाग्रता को बदलने का एक दृष्टिकोण प्रस्तुत किया गया है।
माइग्रेशन और आक्रमण ट्यूमर कोशिकाओं की महत्वपूर्ण विशेषताएं हैं। ट्यूमर कोशिकाओं की गतिशीलता को मापना और अंतर्निहित तंत्र को समझना जो ट्यूमर सेल गतिशीलता को नियंत्रित करता है, चिकित्सीय हस्तक्षेप<…
The authors have nothing to disclose.
लेखक इस पांडुलिपि को संपादित करने के लिए चिल्ड्रन मर्सी कैनसस सिटी में मेडिकल राइटिंग सेंटर को धन्यवाद देते हैं। इस काम को नताली के ए.आर.टी. फाउंडेशन (टी.पी.) और बच्चों के मर्सी अस्पताल (सीएमएच) और यूनिवर्सिटी ऑफ कंसास कैंसर सेंटर (केयूसीसी) (टी.पी.) से एमसीए पार्टनर्स एडवाइजरी बोर्ड अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 | Agarose gel imaging system |
α-Tubulin antibody | Sigma | T9026 | Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000) |
CIM-plate 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
Crk antibody | BD Biosciences | 610035 | Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500) |
CrkL antibody | Santa Cruz | sc-319 | Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500) |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Cell culture medium |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CV | Buffer used to wash cells |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | Culture medium supplement |
Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32210 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32211 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
Lithium chloride | Invitrogen | AM9480 | Used for RNA precipitation |
Matrigel matrix | Corning | 354234 | Extracellular matrix (ECM) gel |
MEGAscript T7 transcription kit | Invitrogen | AM1334 | Used for RNA synthesis |
Millennium RNA markers | Invitrogen | AM7150 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
Mini centrifuge | ISC BioExpress | C1301P-ISC | Used to spin down cells |
Mouse brain QUICK-Clone cDNA | TaKaRa | 637301 | Source of genes (inserts) for cloning |
NanoQuant | Tecan | M200PRO | Nucleic acid quantification system |
Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system1 |
Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
Neon transfection system 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Electroporation kit |
NorthernMax denaturing gel buffer | Invitrogen | AM8676 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
NorthernMax formaldehyde load dye | Invitrogen | AM8552 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
NorthernMax running buffer | Invitrogen | AM8671 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
Nuclease-free water | Teknova | W3331 | Used for various reactions during mRNA synthesis |
Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager for Western blot analysis | |
pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned |
pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | Source of the FLAG epitope tag |
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Sigma | P2069 | Used for DNA extraction |
PmeI | New England BioLabs | R0560L | Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis |
Poly(A) tailing kit | Invitrogen | AM1350 | Used for poly(A) tail reaction |
Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style) | Corning | 353003 | Used for culturing cells before transfection |
Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style) | Corning | 353001 | Used for culturing transfected cells |
Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | Used to remove protein in the reaction mixture |
Purifier Axiom Class II, Type C1 | Labconco Corporation | 304410001 | Biosafety cabinet for sterile handling of cells |
Resuspension Buffer R | ThermoFisher Scientific | A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information. | |
RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | RNA decontamination solution |
Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit | Cellscript | C-SCMT0625 | Used for capping reaction |
ScriptCap m7G capping system | Cellscript | C-SCCE0625 | Used for capping reaction |
Sodium dodecyl sulfate solution | Invitrogen | 15553-035 | Detergent used for the proteinase K reaction |
Sorvall Legend XT centrifuge | Thermo Scientific | 75004532 | Benchtop centrifuge to spin down cells |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Used for dissociation of cells |
U-118MG | ATCC | HTB15 | An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient |
Vinculin antibody | Sigma | V9131 | Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000) |
xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for real-time cell analysis |
1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?). |