Muitos genes regulados estimulam a migração e invasão de células tumorais, levando a um prognóstico ruim. Determinar quais genes regulam a migração e invasão de células tumorais é fundamental. Este protocolo apresenta um método para investigar os efeitos do aumento da expressão de um gene sobre a migração e invasão de células tumorais em tempo real.
As células tumorais são altamente móveis e invasivas e apresentam padrões alterados de expressão gênica. O conhecimento de como as alterações na expressão gênica regulam a migração e invasão de células tumorais é essencial para a compreensão dos mecanismos de infiltração de células tumorais em tecidos saudáveis vizinhos e metástases. Anteriormente, foi demonstrado que o knockdown gênico seguido da medição em tempo real baseada em impedância da migração e invasão de células tumorais permite a identificação dos genes necessários para a migração e invasão de células tumorais. Recentemente, as vacinas de mRNA contra SARS-CoV-2 aumentaram o interesse em usar mRNA sintético para fins terapêuticos. Aqui, o método usando mRNA sintético foi revisado para estudar o efeito da superexpressão gênica na migração e invasão de células tumorais. Este estudo demonstra que a expressão gênica elevada com transfecção de RNAm sintético seguida de medição em tempo real baseada em impedância pode ajudar a identificar os genes que estimulam a migração e invasão de células tumorais. Este artigo fornece detalhes importantes sobre os procedimentos para examinar o efeito da expressão gênica alterada na migração e invasão de células tumorais.
A motilidade das células tumorais desempenha um papel crucial na metástase1,2. A disseminação de células tumorais para tecidos saudáveis vizinhos e remotos dificulta o tratamento do câncer e contribui para arecidiva3,4. Portanto, é essencial compreender os mecanismos de motilidade celular tumoral e desenvolver estratégias terapêuticas relevantes. Como muitas células tumorais apresentam perfis de expressão gênica alterados, é crucial entender quais alterações no perfil de expressão gênica levam à alteração da motilidade das célulastumorais5,6.
Vários ensaios têm sido desenvolvidos para medir a migração celular in vitro. Alguns ensaios fornecem apenas informações limitadas por permitirem apenas medições em momentos específicos, enquanto outros oferecem informações abrangentes sobre a motilidade celular tumoral em tempo real7. Embora muitos desses ensaios de motilidade celular possam fornecer resultados quantitativos em um determinado momento ou no desfecho, eles falham em fornecer informações suficientemente detalhadas sobre mudanças dinâmicas na taxa de migração celular ao longo do período experimental. Além disso, pode ser difícil examinar possíveis mudanças na taxa de migração celular dependendo do planejamento experimental, tipos de células e números de células. Além disso, os efeitos de tratamentos não complicados podem ser investigados pela simples quantificação de ensaios tradicionais de motilidade, mas quantificações mais sofisticadas podem ser necessárias para estudar os efeitos complexos de vários tratamentos combinados8.
Foi desenvolvido um instrumento para monitorar a corrente elétrica de uma placa de microtitulação coberta com microeletrodos9. A adesão das células à superfície do poço impede o fluxo de elétrons, e a impedância correlaciona-se com a ligação quantitativa e qualitativa das células. A presença dos microeletrodos no fundo do poço permite a medição da adesão, espalhamento e proliferação celular. A presença dos microeletrodos sob uma membrana microporosa da câmara superior permite medir a migração e invasão celular para a câmara inferior, com a câmara superior revestida com proteínas da matriz extracelular (MEC) para permitir a invasão10.
Anteriormente, foi demonstrado que medidas em tempo real baseadas em impedância da migração e invasão de células tumorais fornecem dados em tempo real durante todo o experimento, bem como comparações e quantificações instantâneas sob várias condiçõesexperimentais11. Nesse artigo, o knockdown gênico foi induzido para testar o papel de proteínas de interesse na migração e invasão de células tumorais. Como um efeito knockdown completo do gene nas condições experimentais testadas levou 3-4 dias após a eletroporação com pequenos RNAs interferentes (siRNAs)8, as células foram replaqueadas após a eletroporação e recolhidas 3 dias depois para a medição em tempo real baseada em impedância da migração e invasão de células tumorais.
CT10 regulador da quinase (Crk) e Crk-like (CrkL) são proteínas adaptadoras que medeiam interações proteína-proteína a jusante de várias vias da quinase do receptor do fator de crescimento e vias da tirosina quinase não-receptora12. Níveis elevados das proteínas Crk e CrkL contribuem para o mau prognóstico em vários cânceres humanos, incluindo o glioblastoma13. No entanto, não está claro como as proteínas Crk e CrkL elevadas levam a um prognóstico ruim. Portanto, é importante definir o efeito da superexpressão de Crk e CrkL sobre as funções das células tumorais. Anteriormente, um estudo de knockdown genético foi realizado para demonstrar que os níveis endógenos das proteínas Crk e CrkL são necessários para a migração e invasão de células de glioblastoma8. Aqui, um sistema de ensaio modificado foi desenvolvido para abordar o efeito da superexpressão de Crk e CrkL na migração e invasão de células tumorais.
Recentemente, a síntese in vitro de mRNA e suas aplicações terapêuticas têm chamado atenção renovada devido ao desenvolvimento das vacinas de mRNA contra SARS-CoV-2 (revisado por Verbeke et al.14). Além disso, avanços notáveis têm sido obtidos no uso do RNAm sintético em câncer e outras doenças15,16. A eletroporação de células é um método eficaz para liberar RNAm sintético e induzir modificações genéticas transitórias (revisado por Campillo-Davo et al.17), e o uso de RNAm sintético permite expressão gênica rápida e eficiente em fibroblastosimortalizados18. Este artigo de método combina a superexpressão gênica usando mRNA sintético com análises celulares em tempo real para estudar a migração e invasão de células tumorais. Entretanto, o esquema experimental utilizado para siRNAs não funciona com transfecção de RNAm sintético, pois o nível de proteínas exógenas aumenta rapidamente e diminui gradualmente com a transfecção de RNAm sintético18. Portanto, o método foi modificado para realizar a análise em tempo real da migração e invasão celular logo após a transfecção sem a cultura adicional das células.
Este artigo de método demonstra que a combinação de medidas em tempo real baseadas em impedância com a transfecção de células tumorais com mRNAs sintéticos fornece uma análise rápida e abrangente dos efeitos da upregulation gênica na migração e invasão de células tumorais. Este artigo descreve procedimentos detalhados para medir como a migração e invasão de células de glioblastoma são afetadas pela superexpressão de Crk e CrkL. Ao examinar os efeitos dependentes da concentração do mRNA sintético na migração de células tumorais, o artigo descreve claramente como um aumento nos níveis de proteína estimula a migração de células tumorais. Além disso, uma abordagem de variação da concentração do gel de MEC é apresentada para avaliar os efeitos de alterações na expressão gênica sobre a invasão de células tumorais.
Migração e invasão são características importantes das células tumorais. A mensuração da motilidade das células tumorais e a compreensão do mecanismo subjacente que controla a motilidade das células tumorais fornecem informações críticas para intervenções terapêuticas 2,27. Vários métodos têm sido desenvolvidos para estudar a migração celular7. O ensaio de cicatrização de feridas com arranhões ou pastilhas de cultu…
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem ao Medical Writing Center at Children’s Mercy Kansas City pela edição deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela Fundação A.R.T. de Natalie (para T.P.) e por uma concessão do Conselho Consultivo de Parceiros da MCA do Children’s Mercy Hospital (CMH) e do University of Kansas Cancer Center (KUCC) (para T.P.).
AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 | Agarose gel imaging system |
α-Tubulin antibody | Sigma | T9026 | Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000) |
CIM-plate 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
Crk antibody | BD Biosciences | 610035 | Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500) |
CrkL antibody | Santa Cruz | sc-319 | Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500) |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Cell culture medium |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CV | Buffer used to wash cells |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | Culture medium supplement |
Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32210 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32211 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
Lithium chloride | Invitrogen | AM9480 | Used for RNA precipitation |
Matrigel matrix | Corning | 354234 | Extracellular matrix (ECM) gel |
MEGAscript T7 transcription kit | Invitrogen | AM1334 | Used for RNA synthesis |
Millennium RNA markers | Invitrogen | AM7150 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
Mini centrifuge | ISC BioExpress | C1301P-ISC | Used to spin down cells |
Mouse brain QUICK-Clone cDNA | TaKaRa | 637301 | Source of genes (inserts) for cloning |
NanoQuant | Tecan | M200PRO | Nucleic acid quantification system |
Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system1 |
Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
Neon transfection system 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Electroporation kit |
NorthernMax denaturing gel buffer | Invitrogen | AM8676 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
NorthernMax formaldehyde load dye | Invitrogen | AM8552 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
NorthernMax running buffer | Invitrogen | AM8671 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
Nuclease-free water | Teknova | W3331 | Used for various reactions during mRNA synthesis |
Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager for Western blot analysis | |
pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned |
pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | Source of the FLAG epitope tag |
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Sigma | P2069 | Used for DNA extraction |
PmeI | New England BioLabs | R0560L | Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis |
Poly(A) tailing kit | Invitrogen | AM1350 | Used for poly(A) tail reaction |
Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style) | Corning | 353003 | Used for culturing cells before transfection |
Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style) | Corning | 353001 | Used for culturing transfected cells |
Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | Used to remove protein in the reaction mixture |
Purifier Axiom Class II, Type C1 | Labconco Corporation | 304410001 | Biosafety cabinet for sterile handling of cells |
Resuspension Buffer R | ThermoFisher Scientific | A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information. | |
RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | RNA decontamination solution |
Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit | Cellscript | C-SCMT0625 | Used for capping reaction |
ScriptCap m7G capping system | Cellscript | C-SCCE0625 | Used for capping reaction |
Sodium dodecyl sulfate solution | Invitrogen | 15553-035 | Detergent used for the proteinase K reaction |
Sorvall Legend XT centrifuge | Thermo Scientific | 75004532 | Benchtop centrifuge to spin down cells |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Used for dissociation of cells |
U-118MG | ATCC | HTB15 | An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient |
Vinculin antibody | Sigma | V9131 | Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000) |
xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for real-time cell analysis |
1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?). |