Kvantitativ mätning i realtid av tumörcellsmigration och invasion efter syntetisk mRNA-transfektion

Summary

Många uppreglerade gener stimulerar tumörcellers migration och invasion, vilket leder till dålig prognos. Att avgöra vilka gener som reglerar tumörcellers migration och invasion är avgörande. Detta protokoll presenterar en metod för att undersöka effekterna av det ökade uttrycket av en gen på migration och invasion av tumörceller i realtid.

Abstract

Tumörceller är mycket rörliga och invasiva och uppvisar förändrade genuttrycksmönster. Kunskap om hur förändringar i genuttryck reglerar tumörcellers migration och invasion är avgörande för att förstå mekanismerna för tumörcellers infiltration i närliggande friska vävnader och metastaser. Tidigare har det visats att genknockdown följt av impedansbaserad realtidsmätning av tumörcellers migration och invasion möjliggör identifiering av de gener som krävs för tumörcellers migration och invasion. På senare tid har mRNA-vaccinerna mot SARS-CoV-2 ökat intresset för att använda syntetiskt mRNA i terapeutiskt syfte. Här reviderades metoden med syntetiskt mRNA för att studera effekten av överuttryck av gener på tumörcellers migration och invasion. Denna studie visar att förhöjt genuttryck med syntetisk mRNA-transfektion följt av impedansbaserad realtidsmätning kan hjälpa till att identifiera de gener som stimulerar tumörcellsmigration och invasion. Denna metodartikel ger viktiga detaljer om procedurerna för att undersöka effekten av förändrat genuttryck på tumörcellsmigration och invasion.

Introduction

Tumörcellernas rörlighet spelar en avgörande roll vid metastasering ^1,2. Spridningen av tumörceller till närliggande och avlägsna friska vävnader försvårar cancerbehandling och bidrar till återfall ^3,4. Därför är det viktigt att förstå mekanismerna för tumörcellernas rörlighet och utveckla relevanta terapeutiska strategier. Eftersom många tumörceller har förändrade genuttrycksprofiler är det viktigt att förstå vilka förändringar i genuttrycksprofilen som leder till förändrad tumörcellsrörlighet ^5,6.

Flera analyser har utvecklats för att mäta cellmigration in vitro. Vissa analyser ger endast begränsad information på grund av att de endast tillåter mätningar vid specifika tidpunkter, medan andra erbjuder omfattande information om tumörcellernas rörlighet i realtid⁷. Även om många av dessa cellmotilitetsanalyser kan ge kvantitativa resultat vid en given tidpunkt eller slutpunkt, ger de inte tillräckligt detaljerad information om dynamiska förändringar i cellmigrationshastigheten under experimentperioden. Dessutom kan det vara svårt att undersöka potentiella förändringar i cellmigrationshastigheten beroende på experimentell design, celltyper och cellantal. Dessutom kan effekterna av okomplicerade behandlingar undersökas genom enkel kvantifiering av traditionella motilitetsanalyser, men mer sofistikerad kvantifiering kan krävas för att studera de komplexa effekterna av olika kombinerade behandlingar⁸.

Ett instrument för att övervaka den elektriska strömmen i en mikrotiterplattas botten täckt med mikroelektroder^{har utvecklats}. Vidhäftningen av celler till brunnens yta hindrar elektronflödet, och impedansen korrelerar med den kvantitativa och kvalitativa bindningen av cellerna. Närvaron av mikroelektroderna på brunnens botten möjliggör mätning av cellvidhäftning, spridning och proliferation. Närvaron av mikroelektroderna under ett mikroporöst membran i den övre kammaren möjliggör mätning av cellmigration och invasion i den nedre kammaren, med den övre kammaren belagd med extracellulära matrisproteiner (ECM) för att möjliggöra invasion¹⁰.

Tidigare har det visats att impedansbaserade realtidsmätningar av tumörcellers migration och invasion ger realtidsdata under hela experimentet, såväl som omedelbara jämförelser och kvantifieringar under olika experimentella förhållanden¹¹. I den metodartikeln inducerades genknockdown för att testa vilken roll proteiner av intresse spelar för tumörcellers migration och invasion. Eftersom en fullskalig genknockdown-effekt under de testade experimentella förhållandena tog 3-4 dagar efter elektroporering med små interfererande RNA (siRNA)⁸, ompläterades cellerna efter elektroporeringen och återskördades 3 dagar senare för impedansbaserad realtidsmätning av tumörcellmigration och invasion.

CT10-regulator av kinas (Crk) och Crk-liknande (CrkL) är adapterproteiner som förmedlar protein-proteininteraktioner nedströms olika tillväxtfaktorreceptorkinasvägar och icke-receptortyrosinkinasvägar¹². Förhöjda nivåer av Crk- och CrkL-proteiner bidrar till dålig prognos vid flera humana cancerformer, inklusive glioblastom¹³. Det är dock oklart hur förhöjda Crk- och CrkL-proteiner leder till en dålig prognos. Därför är det viktigt att definiera effekten av Crk och CrkL-överuttryck på tumörcellsfunktioner. Tidigare har en genknockdown-studie utförts för att visa att endogena nivåer av Crk- och CrkL-proteiner krävs för glioblastomcellmigration och invasion⁸. Här har ett modifierat analyssystem utvecklats för att ta itu med effekten av Crk- och CrkL-överuttryck på tumörcellsmigration och invasion.

På senare tid har in vitro-syntesen av mRNA och dess terapeutiska tillämpningar fått förnyad uppmärksamhet på grund av utvecklingen av mRNA-vaccinerna mot SARS-CoV-2 (granskad av Verbeke et ^al.14). Dessutom har anmärkningsvärda framsteg gjorts när det gäller att använda syntetiskt mRNA vid cancer och andra sjukdomar^15,16. Elektroporering av celler är en effektiv metod för att leverera syntetiskt mRNA och inducera övergående genetisk modifiering (granskad av Campillo-Davo et ^al.17), och användningen av syntetiskt mRNA möjliggör snabbt och effektivt genuttryck i odödliga fibroblaster¹⁸. Denna metodartikel kombinerar genöveruttryck med hjälp av syntetiskt mRNA med cellanalyser i realtid för att studera tumörcellers migration och invasion. Det experimentella schemat som används för siRNA fungerar dock inte med syntetisk mRNA-transfektion, eftersom nivån av exogena proteiner ökar snabbt och minskar gradvis vid syntetisk mRNA-transfektion¹⁸. Därför har metoden modifierats för att utföra realtidsanalys av cellmigration och invasion direkt efter transfektionen utan att ytterligare odla cellerna.

Denna metodartikel visar att en kombination av impedansbaserade realtidsmätningar med transfektion av tumörceller med syntetiska mRNA ger en snabb och omfattande analys av effekterna av genuppreglering på tumörcellers migration och invasion. Denna metodartikel beskriver detaljerade procedurer för att mäta hur glioblastomcellernas migration och invasion påverkas av överuttryck av Crk och CrkL. Genom att undersöka de koncentrationsberoende effekterna av syntetiskt mRNA på tumörcellsmigration beskriver artikeln tydligt hur en ökning av proteinnivåerna stimulerar tumörcellmigration. Dessutom presenteras ett tillvägagångssätt för att variera koncentrationen av ECM-gelen för att bedöma effekterna av förändringar i genuttryck på tumörcellsinvasion.

Protocol

1. Syntes av mRNA OBS: För mRNA-syntesen måste alla reagenser och utrustning specialbehandlas för att inaktivera RNaserna före användning. Se materialtabellen för detaljer om alla material, instrument och reagenser som används i detta protokoll. Linjärisering av DNAOBS: Mus-cDNA från CrkI och CrkL klonades in i pFLAG-CMV-5a-uttrycksvektorn för att lägga till FLAG-epitoptaggen vid C-terminalen och subklonades till pcDNA3.1/myc-…

Representative Results

Crk- och CrkL-proteiner spelar viktiga roller i motiliteten hos många celltyper, inklusive neuroner22, T-celler23, fibroblaster 18,19 och en mängd olika tumörceller13. Eftersom Crk- och CrkL-proteiner har rapporterats vara förhöjda i glioblastom24,25,26, studerades effekterna av överuttryck av CrkI, en skarvvariant av Crk,<sup c…

Discussion

Migration och invasion är viktiga egenskaper hos tumörceller. Att mäta tumörcellers rörlighet och förstå den underliggande mekanismen som styr tumörcellernas rörlighet ger viktiga insikter om terapeutiska interventioner ^2,27. Flera metoder har utvecklats för att studera cellmigration⁷. Sårläkningsanalysen med repor eller odlingsinsatser är en enkel och ofta använd metod som ger kontrasterande bilder av spaltförslutning. Den …

Materials

AlphaImager HP	ProteinSimple	92-13823-00	Agarose gel imaging system
α-Tubulin antibody	Sigma	T9026	Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000)
CIM-plate 16	Agilent Technologies, Inc	5665825001	Cell invasion and migration plates
Crk antibody	BD Biosciences	610035	Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)
CrkL antibody	Santa Cruz	sc-319	Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	ATCC	302002	Cell culture medium
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CV	Buffer used to wash cells
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30910.03	Culture medium supplement
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	Thermo Scientific	51030285	CO2 incubator
IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody	Li-Cor	926-32210	Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)
IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody	Li-Cor	926-32211	Secondary antibody for Western blot analysis  (dilution 1:10,000)
Lithium chloride	Invitrogen	AM9480	Used for RNA precipitation
Matrigel matrix	Corning	354234	Extracellular matrix (ECM) gel
MEGAscript T7 transcription kit	Invitrogen	AM1334	Used for RNA synthesis
Millennium RNA markers	Invitrogen	AM7150	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Mini centrifuge	ISC BioExpress	C1301P-ISC	Used to spin down cells
Mouse brain QUICK-Clone cDNA	TaKaRa	637301	Source of genes (inserts) for cloning
NanoQuant	Tecan	M200PRO	Nucleic acid quantification system
Neon electroporation system	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Electroporation system1
Neon transfection system 10 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK1025	Electroporation kit
Neon transfection system 100 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK10096	Electroporation kit
NorthernMax denaturing gel buffer	Invitrogen	AM8676	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax formaldehyde load dye	Invitrogen	AM8552	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax running buffer	Invitrogen	AM8671	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Nuclease-free water	Teknova	W3331	Used for various reactions during mRNA synthesis
Odyssey CLx Imager	Li-Cor		Imager for Western blot analysis
pcDNA3.1/myc-His	Invitrogen	V80020	The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned
pFLAG-CMV-5a	Millipore Sigma	E7523	Source of the FLAG epitope tag
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Sigma	P2069	Used for DNA extraction
PmeI	New England BioLabs	R0560L	Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis
Poly(A) tailing kit	Invitrogen	AM1350	Used for poly(A) tail reaction
Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style)	Corning	353003	Used for culturing cells before transfection
Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style)	Corning	353001	Used for culturing transfected cells
Proteinase K	Invitrogen	25530049	Used to remove protein in the reaction mixture
Purifier Axiom Class II, Type C1	Labconco Corporation	304410001	Biosafety cabinet for sterile handling of cells
Resuspension Buffer R	ThermoFisher Scientific		A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.
RNaseZap	Invitrogen	AM9780	RNA decontamination solution
Scepter	Millipore	C85360	Handheld automated cell counter
ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit	Cellscript	C-SCMT0625	Used for capping reaction
ScriptCap m7G capping system	Cellscript	C-SCCE0625	Used for capping reaction
Sodium dodecyl sulfate solution	Invitrogen	15553-035	Detergent used for the proteinase K reaction
Sorvall Legend XT centrifuge	Thermo Scientific	75004532	Benchtop centrifuge to spin down cells
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	Used for dissociation of cells
U-118MG	ATCC	HTB15	An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient
Vinculin antibody	Sigma	V9131	Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)
xCELLigence RTCA DP	Agilent Technologies, Inc	380601050	Instrument used for real-time cell analysis
1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).