Sentetik mRNA Transfeksiyonunu Takiben Tümör Hücresi Migrasyonu ve İnvazyonunun Gerçek Zamanlı Kantitatif Ölçümü
Summary
Birçok yukarı regüle edilmiş gen, tümör hücresi göçünü ve invazyonunu uyararak kötü prognoza yol açar. Hangi genlerin tümör hücresi göçünü ve invazyonunu düzenlediğini belirlemek çok önemlidir. Bu protokol, bir genin artan ekspresyonunun tümör hücrelerinin göçü ve invazyonu üzerindeki etkilerini gerçek zamanlı olarak araştırmak için bir yöntem sunar.
Abstract
Tümör hücreleri oldukça hareketli ve invazivdir ve değişmiş gen ekspresyon paternleri sergiler. Gen ekspresyonundaki değişikliklerin tümör hücresi göçünü ve invazyonunu nasıl düzenlediğinin bilinmesi, tümör hücresinin komşu sağlıklı dokulara infiltrasyon ve metastaz mekanizmalarını anlamak için gereklidir. Daha önce, tümör hücresi göçü ve invazyonunun empedans tabanlı gerçek zamanlı ölçümünün ardından gen yıkımının, tümör hücresi göçü ve invazyonu için gerekli genlerin tanımlanmasını sağladığı gösterilmişti. Son zamanlarda, SARS-CoV-2’ye karşı mRNA aşıları, terapötik amaçlar için sentetik mRNA kullanımına olan ilgiyi artırmıştır. Burada, sentetik mRNA kullanan yöntem, gen aşırı ekspresyonunun tümör hücresi göçü ve invazyonu üzerindeki etkisini incelemek için revize edildi. Bu çalışma, sentetik mRNA transfeksiyonu ve ardından empedans tabanlı gerçek zamanlı ölçüm ile yükseltilmiş gen ekspresyonunun tümör hücresi göçünü ve invazyonunu uyaran genlerin belirlenmesine yardımcı olabileceğini göstermektedir. Bu yöntem belgesi, değiştirilmiş gen ekspresyonunun tümör hücresi göçü ve invazyonu üzerindeki etkisini inceleme prosedürleri hakkında önemli ayrıntılar sağlar.
Introduction
Tümör hücresi motilitesi metastazda çok önemli bir rol oynar 1,2. Tümör hücrelerinin komşu ve uzak sağlıklı dokulara yayılması kanser tedavisini zorlaştırır ve nüksetmeye katkıda bulunur 3,4. Bu nedenle, tümör hücresi motilitesinin mekanizmalarını anlamak ve ilgili terapötik stratejiler geliştirmek esastır. Birçok tümör hücresi gen ekspresyon profillerini değiştirdiğinden, gen ekspresyon profilindeki hangi değişikliklerin tümör hücresi motilitesinindeğişmesine yol açtığını anlamak çok önemlidir 5,6.
Hücre göçünü in vitro olarak ölçmek için çeşitli testler geliştirilmiştir. Bazı tahliller, yalnızca belirli zaman noktalarında ölçümlere izin verdiği için yalnızca sınırlı bilgi sağlarken, diğerleri gerçek zamanlı olarak tümör hücresi motilitesi hakkında kapsamlı bilgi sunar7. Bu hücre motilite testlerinin birçoğu belirli bir zamanda veya son noktada nicel sonuçlar sağlayabilse de, deney süresi boyunca hücre göçü hızındaki dinamik değişiklikler hakkında yeterince ayrıntılı bilgi sağlayamamaktadır. Ek olarak, deneysel tasarıma, hücre tiplerine ve hücre sayılarına bağlı olarak hücre göç hızındaki potansiyel değişiklikleri incelemek zor olabilir. Ayrıca, komplike olmayan tedavilerin etkileri, geleneksel motilite testlerinin basit miktar tayini ile araştırılabilir, ancak çeşitli kombine tedavilerin karmaşık etkilerini incelemek için daha karmaşık miktar tayini gerekebilir8.
Mikroelektrotlarla kaplanmış bir mikrotitre plakasının elektrik akımını izlemek için bir cihaz geliştirilmiştir9. Hücrelerin kuyu yüzeyine yapışması elektron akışını engeller ve empedans, hücrelerin kantitatif ve nitel bağlanması ile ilişkilidir. Kuyu dibinde mikroelektrotların varlığı, hücre yapışmasının, yayılmasının ve çoğalmasının ölçülmesine izin verir. Üst kamaranın mikro gözenekli bir zarının altında mikroelektrotların varlığı, hücre göçünün ve alt bölmeye invazyonun ölçülmesine izin verir, üst bölme invazyona izin vermek için hücre dışı matris (ECM) proteinleri ile kaplanır10.
Daha önce, tümör hücresi göçü ve invazyonunun empedans tabanlı gerçek zamanlı ölçümlerinin, tüm deney boyunca gerçek zamanlı verilerin yanı sıra çeşitli deneysel koşullar altında anlık karşılaştırmalar ve nicelemeler sağladığı gösterilmiştir11. Bu yöntem makalesinde, tümör hücresi göçü ve istilasında ilgilenilen proteinlerin rolünü test etmek için gen yıkımı indüklendi. Test edilen deney koşulları altında tam gelişmiş bir gen yıkım etkisi, küçük enterferans yapan RNA’lar (siRNA’lar)8 ile elektroporasyondan 3-4 gün sonra sürdüğünden, hücreler elektroporasyondan sonra yeniden kaplandı ve tümör hücresi göçünün ve invazyonunun empedans tabanlı gerçek zamanlı ölçümü için 3 gün sonra yeniden toplandı.
Kinaz (Crk) ve Crk benzeri (CrkL) CT10 regülatörü, çeşitli büyüme faktörü reseptör kinaz yolaklarının ve reseptör olmayan tirozin kinaz yolaklarının12 aşağı akışında protein-protein etkileşimlerine aracılık eden adaptör proteinlerdir. Yüksek Crk ve CrkL protein seviyeleri, glioblastoma13 dahil olmak üzere birçok insan kanserinde kötü prognoza katkıda bulunur. Bununla birlikte, yüksek Crk ve CrkL proteinlerinin nasıl kötü bir prognoza yol açtığı açık değildir. Bu nedenle, Crk ve CrkL aşırı ekspresyonunun tümör hücre fonksiyonları üzerindeki etkisini tanımlamak önemlidir. Daha önce, glioblastoma hücre göçü ve invazyonu için endojen seviyelerde Crk ve CrkL proteinlerinin gerekli olduğunu göstermek için bir gen yıkım çalışması yapılmıştır8. Burada, Crk ve CrkL aşırı ekspresyonunun tümör hücresi göçü ve invazyonu üzerindeki etkisini ele almak için modifiye edilmiş bir test sistemi geliştirilmiştir.
Son zamanlarda, mRNA’nın in vitro sentezi ve terapötik uygulamaları, SARS-CoV-2’ye karşı mRNA aşılarının geliştirilmesi nedeniyle yeniden dikkat çekmiştir (Verbeke ve ark.14 tarafından gözden geçirilmiştir). Ayrıca kanser ve diğer hastalıklarda sentetik mRNA kullanımında kayda değer ilerlemeler kaydedilmiştir15,16. Hücrelerin elektroporasyonu, sentetik mRNA iletmek ve geçici genetik modifikasyonu indüklemek için etkili bir yöntemdir (Campillo-Davo ve ark.17 tarafından gözden geçirilmiştir) ve sentetik mRNA kullanımı, ölümsüzleştirilmiş fibroblastlardahızlı ve verimli gen ekspresyonunu sağlar 18. Bu yöntem makalesi, tümör hücresi göçünü ve invazyonunu incelemek için sentetik mRNA kullanarak gen aşırı ekspresyonunu gerçek zamanlı hücre analizleriyle birleştirir. Bununla birlikte, siRNA’lar için kullanılan deneysel şema, sentetik mRNA transfeksiyonu ile çalışmaz, çünkü eksojen proteinlerin seviyesi hızla artar ve sentetik mRNA transfeksiyonu18 üzerine kademeli olarak azalır. Bu nedenle, yöntem, hücreleri ek olarak kültürlemeden, transfeksiyondan hemen sonra hücre göçü ve istilasının gerçek zamanlı analizini gerçekleştirmek için değiştirilmiştir.
Bu yöntem makalesi, empedans tabanlı gerçek zamanlı ölçümlerin tümör hücrelerinin sentetik mRNA’larla transfeksiyonu ile birleştirilmesinin, gen yukarı regülasyonunun tümör hücresi göçü ve invazyonu üzerindeki etkilerinin hızlı ve kapsamlı bir analizini sağladığını göstermektedir. Bu yöntem belgesi, glioblastoma hücrelerinin göçünün ve istilasının Crk ve CrkL’nin aşırı ekspresyonundan nasıl etkilendiğini ölçmek için ayrıntılı prosedürleri açıklamaktadır. Makale, sentetik mRNA’nın tümör hücresi göçü üzerindeki konsantrasyona bağlı etkilerini inceleyerek, protein seviyelerindeki artışın tümör hücresi göçünü nasıl uyardığını açıkça açıklamaktadır. Ek olarak, gen ekspresyonundaki değişikliklerin tümör hücresi invazyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için ECM jelinin konsantrasyonunu değiştiren bir yaklaşım sunulmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Göç ve invazyon tümör hücrelerinin önemli özellikleridir. Tümör hücrelerinin motilitesinin ölçülmesi ve tümör hücresi motilitesinin kontrol edilmesinin altında yatan mekanizmanın anlaşılması, terapötik müdahaleler hakkında kritik bilgiler sağlar 2,27. Hücre göçünü incelemek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir7. Çizikler veya kültür ekleri kullanılarak yapılan yara iyileşme testi, boşluk kapanm…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu makaleyi düzenlediği için Children’s Mercy Kansas City’deki Tıbbi Yazım Merkezi’ne teşekkür eder. Bu çalışma, Natalie’nin A.R.T. Vakfı (T.P.’ye) ve Children’s Mercy Hospital (CMH) ve Kansas Üniversitesi Kanser Merkezi’nden (KUCC) (T.P.’ye) MCA Partners Danışma Kurulu hibesi ile desteklenmiştir.
Materials
| AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 | Agarose gel imaging system |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T9026 | Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000) |
| CIM-plate 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk antibody | BD Biosciences | 610035 | Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500) |
| CrkL antibody | Santa Cruz | sc-319 | Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Cell culture medium |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CV | Buffer used to wash cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | Culture medium supplement |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32210 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32211 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| Lithium chloride | Invitrogen | AM9480 | Used for RNA precipitation |
| Matrigel matrix | Corning | 354234 | Extracellular matrix (ECM) gel |
| MEGAscript T7 transcription kit | Invitrogen | AM1334 | Used for RNA synthesis |
| Millennium RNA markers | Invitrogen | AM7150 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Mini centrifuge | ISC BioExpress | C1301P-ISC | Used to spin down cells |
| Mouse brain QUICK-Clone cDNA | TaKaRa | 637301 | Source of genes (inserts) for cloning |
| NanoQuant | Tecan | M200PRO | Nucleic acid quantification system |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system1 |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Neon transfection system 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Electroporation kit |
| NorthernMax denaturing gel buffer | Invitrogen | AM8676 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax formaldehyde load dye | Invitrogen | AM8552 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax running buffer | Invitrogen | AM8671 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Nuclease-free water | Teknova | W3331 | Used for various reactions during mRNA synthesis |
| Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager for Western blot analysis | |
| pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned |
| pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | Source of the FLAG epitope tag |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Sigma | P2069 | Used for DNA extraction |
| PmeI | New England BioLabs | R0560L | Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis |
| Poly(A) tailing kit | Invitrogen | AM1350 | Used for poly(A) tail reaction |
| Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style) | Corning | 353003 | Used for culturing cells before transfection |
| Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style) | Corning | 353001 | Used for culturing transfected cells |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | Used to remove protein in the reaction mixture |
| Purifier Axiom Class II, Type C1 | Labconco Corporation | 304410001 | Biosafety cabinet for sterile handling of cells |
| Resuspension Buffer R | ThermoFisher Scientific | A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information. | |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | RNA decontamination solution |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit | Cellscript | C-SCMT0625 | Used for capping reaction |
| ScriptCap m7G capping system | Cellscript | C-SCCE0625 | Used for capping reaction |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Invitrogen | 15553-035 | Detergent used for the proteinase K reaction |
| Sorvall Legend XT centrifuge | Thermo Scientific | 75004532 | Benchtop centrifuge to spin down cells |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Used for dissociation of cells |
| U-118MG | ATCC | HTB15 | An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient |
| Vinculin antibody | Sigma | V9131 | Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000) |
| xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for real-time cell analysis |
| 1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?). |
Referências
- Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
- Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma. Frontiers in Oncology. 10, 92 (2020).
- Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion. Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).
- Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes. Life Sciences. 211, 206-214 (2018).
- Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types. Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Park, T., Large, N., Curran, T. Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390 (2021).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).
- Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
- Mudduluru, G., Large, N., Park, T. Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion. Journal of Visualized Experiments. (158), e60997 (2020).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment. Cells. 10 (4), 739 (2021).
- Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case. Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).
- Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases. Molecular Cancer. 20 (1), 52 (2021).
- Kwon, H., et al. Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine. Biomaterials. 156, 172-193 (2018).
- Campillo-Davo, D., et al. The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy. Pharmaceutics. 13 (3), 396 (2021).
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting. Clinical Chemistry. 30 (6), 958 (1984).
- Pushparaj, P. N. Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice. Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Huang, Y., et al. CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues. The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).
- Wang, L., et al. Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).
- Kumar, S., et al. Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma. Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).
- Kumar, S., et al. Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Raudenska, M., et al. Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases. Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).
- Farasani, A., Darbre, P. D. Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro. Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).
- Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).
- Lago-Baameiro, N., et al. PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells. Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).
- Escalona, R. M., et al. Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer. Cancer Cell International. 22 (1), 422 (2022).
- Mosca, L., et al. Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms. International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).
- Zhao, Q., et al. VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma. International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).
- Witte, D., et al. TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK. Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).
- Bui, L. C., et al. Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration. Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line. The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).
