Generación de un modelo de decidualización artificial de ratón con ovariectomía para la investigación de la decidualización endometrial

Summary

Aquí, describimos el método de generación de un modelo de decidualización artificial utilizando el ratón ovariectomizado, un experimento clásico de decidualización endometrial en el campo de investigación de la decidualización endometrial.

Abstract

La decidualización endometrial es un proceso de diferenciación único del endometrio, estrechamente relacionado con la menstruación y el embarazo. El deterioro de la decidualización conduce a diversos trastornos endometriales, como infertilidad, aborto espontáneo recurrente y parto prematuro. El desarrollo y uso del modelo de decidualización endometrial en estudios reproductivos ha sido un punto culminante para los investigadores reproductivos durante mucho tiempo. El ratón ha sido ampliamente utilizado en el estudio de la reproducción y la decidualización. Hay tres modelos de ratón bien establecidos con respecto a la decidualización, a saber, la decidualización natural del embarazo (NPD), la decidualización artificial (AD) y la decidualización in vitro (IVD). Entre ellos, AD se considera un modelo confiable para la decidualización del mouse, que es fácil de implementar y cercano a NPD. Este trabajo se centra en un método modificado del proceso de generación y aplicación del modelo de decidualización artificial de ratón con ovariectomía para evitar efectos ováricos, que pueden obtener resultados altamente reproducibles con pequeñas varianzas dentro del grupo. Este método proporciona un modelo animal bueno y confiable para el estudio de la decidualización endometrial.

Introduction

Con el desarrollo de la tecnología de reproducción asistida por humanos, la tasa actual de embarazo clínico de fertilización in vitro-transferencia de embriones (FIV-ET) ha alcanzado o incluso superado la del embarazo natural. A pesar de ello, muchas pacientes en la práctica clínica de reproducción asistida todavía se someten a múltiples transferencias embrionarias pero no logran el embarazo deseado. Sin embargo, su mecanismo molecular específico aún no está claro, por lo que la intervención clínica es ineficaz, lo que es uno de los desafíos significativos que enfrenta la medicina reproductiva ^1,2.

Los factores endometriales representan cerca de dos tercios de las causas del fracaso de la FIV³. La implantación del embrión humano se divide en tres etapas: posicionamiento, adhesión e invasión ^4,5,6. El endometrio materno sufre una serie de cambios para cumplir con la llegada del embrión. La formación de un “período ventana” de implantación proporciona condiciones favorables para la implantación del embrión ^7,8.

En la mayoría de los mamíferos, después de que el blastocisto se adhiere al epitelio luminal del útero, las células estromales que rodean el blastocisto rápidamente comienzan a proliferar y diferenciarse, y la rápida remodelación del mesénquima cambia su forma y función, lo que lleva a la implantación del embrión 5,9,10. El rápido aumento en el volumen y el peso del sitio permite que el blastocisto se incruste en el estroma uterino, un proceso conocido como decidualización¹¹. El estroma endometrial se diferencia y remodela en preparación para el embarazo, mientras que la transición de las células estromales proporciona espacio y nuevas conexiones de señalización para que las células deciduales realicen sus funciones^12,13. Las células estromales se transforman en células deciduales y secretan muchos factores icónicos como la prolactina (PRL), la proteína 1 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (Igfbp1), etc. Los estudios han demostrado que la decidualización anormal es una de las razones clave para el fracaso de la implantación embrionaria, pero la causa de la decidualización anormal aún no está clara y necesita ser^{dilucidada más 1,14}.

El modelo de decidualización artificial de ratón es esencial para estudiar el proceso fisiológico y los mecanismos moleculares subyacentes a la decidualización. La decidualización artificial (DA) se refiere principalmente al proceso de decidualización endometrial establecido por métodos artificiales para simular el embarazo o el ciclo menstrual. En términos de morfología, hay poca diferencia general entre la decidualización del embarazo y la decidualización artificial^15,16. Las glándulas uterinas existen en el endometrio antes de que se formen las deciduas y desaparecen después de la decidualización. En cuanto a la expresión génica, solo se identifica una ligera diferencia entre la decidualización natural del embarazo (NPD) y la AD¹⁵. En consecuencia, el modelo de decidualización artificial en ratones puede simular la decidualización del embarazo para explorar la patogénesis desconocida y el nuevo tratamiento de las enfermedades reproductivas humanas.

NPD, AD y decidualización in vitro (IVD) son tres métodos para lograr la decidualización del ratón. El modelo NPD depende del embarazo natural y es el más cercano al estado fisiológico materno, incluidos los efectos de los embriones. La comparación de las diferencias entre los sitios de implantación y no implantación es un enfoque más fisiológico y conveniente para estudiar la decidualización. El modelo AD se desarrolló mediante el uso de una inyección intrauterina de aceite de sésamo como estimulante para inducir la decidualización en una ratona hembra pseudoembarazada apareada con machos vasectomizados para evitar el impacto de los embriones. Tanto los modelos NPD como AD juegan un papel esencial en diferentes propósitos de investigación, pero no pueden evitar el fracaso del apareamiento y las diferencias dentro del grupo causadas por las diferentes actividades del metabolismo hormonal materno. IVD es un método que depende del tratamiento combinado de estrógeno y progesterona a nivel celular, que requiere condiciones experimentales y capacidad de operación más estrictas. Sin embargo, el modelo in vitro no puede simular completamente la respuesta decidual en condiciones fisiológicas¹⁵. Por lo tanto, proponemos un método de inducción simple y mejorado modificado de la EA tradicional para reducir el efecto de las hormonas endógenas en la decidualización. Basado en garantizar el éxito de la inducción de decidualización, está más cerca del estado fisiológico y es más adecuado para experimentos que necesitan excluir factores embrionarios.

Protocol

Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité sobre el Uso y Cuidado de Animales (No. 20171202) del Hospital Amateur Drum Tower del Hospital Afiliado de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nanjing. Todas las operaciones siguen las pautas nacionales y de cuidado y uso de animales apropiados. NOTA: Los ratones se criaron en un ambiente específico libre de patógenos (SPF), con una temperatura de 22 °C ± 1 °C, humedad relativa de 50% ± 1%, un ciclo de…

Representative Results

Los índices del modelo de decidualización del ratón incluyen la morfología general del útero, la relación de masa del útero decidualizado y no decidualizado, la morfología histológica del endometrio y el nivel de expresión de las moléculas marcadoras de decidualización. La morfología general del útero decidualizado artificial de ratones inducido por aceite es más cercana a la del útero en el embarazo. El cuerpo uterino se vuelve grueso y la cavidad uterina se vuelve más pequeña que el lado no inducido. …

Discussion

La decidualización en ratones es un proceso espontáneo que depende de la presencia de embriones, que es diferente de los humanos. Sin embargo, se ha encontrado que la estimulación artificial, como la inyección uterina de perlas de vidrio y la laceración uterina, puede inducir la decidualización del endometrio en lugar de embriones. Además, los investigadores encontraron que muchos factores podrían inducir deciduales o participar en la decidualización, como la inyección de hormonas esteroides, prostaglandinas y …

Materials

Estrogen	Sigma	E2758	Hormone supplement
Progesterone	Sigma	P0130	Hormone supplement
Sesame oil	Sigma	S3547	Hormone supplement
Sodium pentobarbital	Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.		Anaesthesia
Meloxicam injection	Qilu Animal Health Products Co., Ltd		Analgesia
Alkaline phophatase stain kit(kaplow's/azo coupling method)	Solarbio	G1480	Alkaline phophatase stain
Eosin	Servicebio	G1005-2	HE stain
Hematoxylin	Servicebio	G1005-1	HE stain
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02	qPCR
70% ethanol	Lircon	ZH1120090	Disinfect
Iodophor	Runzekang	RZK-DF	Disinfect
Erythromycin Eye Ointment	Guangzhou Baiyunshan		Mice eyeball protect
4-0 suture	Ethicon	W329	Incision suture
10% formalin	Yulu	L25010118	Tissue fix
Optimal cutting temperature compound	Sakura	4583	Ssection
Trizol reagent	Ambion	15596018	qPCR