Analyse af sult-induceret autofagi i Drosophila melanogaster Larve Fat Body
Summary
Denne protokol beskriver induktion af autofagi i Drosophila melanogaster larvefedtlegemet via næringsstofudtømning og analyserer ændringer i autofagi ved hjælp af transgene fluestammer.
Abstract
Autofagi er en cellulær selvfordøjelsesproces. Det leverer last til lysosomerne til nedbrydning som reaktion på forskellige belastninger, herunder sult. Fejlen i autofagi er forbundet med aldring og flere menneskelige sygdomme. Autofagimaskineriet er meget bevaret – fra gær til mennesker. Larvefedtlegemet af Drosophila melanogaster, en analog til hvirveldyrlever og fedtvæv, giver en unik model til overvågning af autofagi in vivo. Autofagi kan let induceres af næringsstof sult i larvefedtkroppen. De fleste autofagi-relaterede gener bevares i Drosophila. Mange transgene fluestammer, der udtrykker mærkede autofagimarkører, er blevet udviklet, hvilket letter overvågningen af forskellige trin i autofagiprocessen. Den klonale analyse muliggør en tæt sammenligning af autofagimarkører i celler med forskellige genotyper i samme stykke væv. Den nuværende protokol beskriver procedurer for (1) generering af somatiske kloner i larvefedtlegemet, (2) inducering af autofagi via aminosyresult og (3) dissekering af larvefedtlegemet med det formål at skabe en model til analyse af forskelle i autofagi ved hjælp af en autofagosommarkør (GFP-Atg8a) og klonal analyse.
Introduction
Autofagi er en “selvspisende” proces induceret af forskellige belastninger, herunder aminosyre sult1. Makroautofagi (i det følgende benævnt autofagi) er den mest velundersøgte type autofagi og spiller en uerstattelig rolle i opretholdelsen af cellulær homeostase2. Fejlen i autofagi er forbundet med flere menneskelige sygdomme3. Derudover er nogle autofagi-relaterede gener potentielle mål for behandling af forskellige sygdomme4.
Autofagi reguleres på en meget sofistikeret måde5. Ved sult sekvestrerer isolationsmembranerne cytoplasmatiske materialer til dannelse af dobbeltmembranerede autofagosomer6. Autofagosomer smelter derefter sammen med endosomer og lysosomer for at danne amfisomer og autolysosomer. Ved hjælp af lysosomale hydrolytiske enzymer nedbrydes det opslugte cytoplasmatiske indhold, og næringsstofferne genbruges7.
Autofagi er en evolutionært bevaret proces8. Drosophila melanogaster er en fantastisk model til at studere autofagiprocessen in vivo. Aminosyre sult inducerer let autofagi i fluefedt kropsvæv, en analog af humant lever og fedtvæv9. Defekter i autofagi forstyrrer de forskellige punktmønstre af flere autofagi-relaterede proteiner, såsom Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 og p62, blandt andre10. Derfor vil analyse af mønstrene af disse autofagimarkører hjælpe med at skelne forekomsten af autofagifejl og det defekte autofagitrin. For eksempel er det ubiquitinlignende protein Atg8 den mest almindeligt anvendte autofagimarkør11. I Drosophila melanogaster er transgene stammer med et grønt fluorescerende protein (GFP)-mærket Atg8a blevet udviklet med succes12. GFP-Atg8a diffunderes i cytosolen og kernerne i de fodrede celler. Ved sult behandles og modificeres GFP-Atg8a af phosphatidylethanolamin (PE) og danner puncta, som mærker isolationsmembranerne og fuldt udviklede autofagosomer13,14. Gennem direkte fluorescensmikroskopi kan autofagiinduktionen let observeres som en stigning i GFP-Atg8 punktdannelse15. Atg8a puncta ville ikke dannes som reaktion på sult i nærvær af en autofagi initieringsdefekt. Da GFP-Atg8a kan slukkes og fordøjes af den lave pH i autolysosomer, kan GFP-Atg8a punktik stige i antal, hvis autofagi blokeres i sene stadier16.
Da autofagi er meget følsom over for ernæringstilgængelighed17, fører små forskelle i dyrkningsforhold ofte til variationer i fænotyper. Derfor har klonal analyse, en metode, der analyserer mutante celler versus vildtypekontrolceller i samme væv, en stor fordel ved dissekering af autofagidefekter18. Ved at udnytte flippase/flippase-genkendelsesmål (FLP/FRT)-medieret stedspecifik rekombination mellem homologe kromosomer fremstilles fluer, der bærer mosaikvæv, let19,20. Vildtypecellerne omkring mutantcellerne danner en perfekt intern kontrol for at undgå individuelle forskelle21.
Denne undersøgelse beskriver, hvordan man inducerer autofagi ved aminosyresult og genererer GFP-Atg8a-ekspresserende mosaikfedt kropsvæv. Disse protokoller kan bruges til at analysere forskelle i autofagi blandt mutante kloner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver metoderne til (1) at generere fluer, der bærer mutante kloner i larvefedtlegemerne, (2) inducere autofagi gennem aminosyresult og (3) dissekere larvefedtlegemerne. For at generere kloner med succes i larvefedtlegemerne skal følgende kritiske trin udføres flittigt. (1) Timing af varmechokket nøjagtigt er afgørende, fordi mitotisk rekombination kun sker, når vævet gennemgår mitose, og (2) både varmechoktemperatur og varighed er kritiske for at inducere FLP-ekspression. Et standard 37 °C v…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for THFC og BDSC for at levere fluestammerne. Dr. Tong Chao støttes af National Natural Science Foundation of China (32030027, 91754103, 92157201) og grundlæggende forskningsmidler til de centrale universiteter. Vi takker kernefaciliteten i Life Sciences Institute (LSI) for at levere tjenester.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 Forceps | Dumont | RS-5015 | |
| 9 Dressions Spot plate | PYREX | 7220-85 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854-0100 | |
| KCl | Sangon Biotech | A610440-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A600445-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| Laboratory spatula | Fisher | 14-375-10 | |
| Long forceps | R' DEER | RST-14 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | 80340-1130 | |
| Microscope slides | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Composition of 1x PBS solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dish | Corning | 430166 | |
| Standard cornmeal/molasses/agar fly food | Tong Lab-made | ||
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 10021418 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | Recommended mounting medium |
| Fly stocks | |||
| y'w* Iso FRT19A | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | Tong Lab's fly stocks |
Referências
- Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
- Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
- Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
- Mizushima, N., et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).
- Yang, Z., Klionsky, D. J. Eaten alive: A history of macroautophagy. Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).
- Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).
- Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes…Wait,I’mconfused. Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).
- Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes. Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).
- Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).
- Liu, W., et al. Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity. Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).
- Ichimura, Y., et al. A ubiquitin-like system mediates protein lipidation. Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).
- Rusten, T. E., et al. Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway. Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).
- Nishida, Y., et al. Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy. Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).
- Ravikumar, B., et al. Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).
- Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation. Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).
- Shintani, T., Klionsky, D. J. Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).
- Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. Autophagy regulation by nutrient signaling. Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).
- Nagy, P., et al. How and why to study autophagy in Drosophila: It’s more than just a garbage chute. Methods. 75, 151-161 (2015).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
- Senecoff, J. F., Cox, M. M. Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing. Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).
- Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. Mosaic analysis in Drosophila. Genética. 208 (2), 473-490 (2018).
- Zappia, M. P., et al. E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes. eLife. 10, 67753 (2021).
- Demerec, M. . Biology of Drosophila. , (1965).
- Rizki, R. M., et al. Drosophila larval fat body surfaces. Wilhelm Roux’s Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).
- Szeto, J., et al. ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy. Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).
- Renna, M., et al. Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).
- Guo, S., et al. A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages. Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).
- Tian, W., et al. An antibody for analysis of autophagy induction. Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).
- Nezis, I. P. Selective autophagy in Drosophila. International Journal of Cell Biology. 2012, 146767 (2012).
- Chu, Y., et al. Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology. Materials. 14 (15), 4180 (2021).
