Fluoreszierende In situ Hybridisierung und 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin-Markierung für stammähnliche Zellen in der Hydrozoenqualle Cladonema pacificum

Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Visualisierung stammartig wuchernder Zellen in der Qualle Cladonema. Die Whole-mount-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung mit einem Stammzellmarker ermöglicht den Nachweis stammähnlicher Zellen, und die 5-Ethynyl-2′-Desoxyuridin-Markierung ermöglicht die Identifizierung proliferierender Zellen. Zusammen können aktiv wuchernde stammartige Zellen nachgewiesen werden.

Abstract

Nesseltiere, einschließlich Seeanemonen, Korallen und Quallen, zeigen vielfältige Morphologie und Lebensstile, die sich in sitzenden Polypen und frei schwimmenden Medusen manifestieren. Wie etablierte Modelle wie Hydra und Nematostella zeigen, tragen Stammzellen und/oder proliferative Zellen zur Entwicklung und Regeneration von Nesseltierpolypen bei. Die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen in den meisten Quallen, insbesondere im Medusa-Stadium, sind jedoch weitgehend unklar, und daher ist die Entwicklung einer robusten Methode zur Identifizierung spezifischer Zelltypen von entscheidender Bedeutung. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Visualisierung stammartig proliferierender Zellen in der Hydrozoenqualle Cladonema pacificum. Cladonema medusae besitzen verzweigte Tentakel, die während ihres gesamten Erwachsenenstadiums kontinuierlich wachsen und die Regenerationsfähigkeit aufrechterhalten und eine einzigartige Plattform bieten, um die zellulären Mechanismen zu untersuchen, die von proliferierenden und / oder stammartigen Zellen orchestriert werden. Die Whole-mount-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) unter Verwendung eines Stammzellmarkers ermöglicht den Nachweis stammähnlicher Zellen, während die Pulsmarkierung mit 5-Ethynyl-2′-Desoxyuridin (EdU), einem S-Phasenmarker, die Identifizierung proliferierender Zellen ermöglicht. Durch die Kombination von FISH- und EdU-Markierung können wir aktiv proliferierende stammartige Zellen an festen Tieren nachweisen, und diese Technik kann breit auf andere Tiere angewendet werden, einschließlich Nicht-Modell-Quallenarten.

Introduction

Cnidaria gilt als basal verzweigter Metazoenstamm, der Tiere mit Nerven und Muskeln enthält, was sie in eine einzigartige Position für das Verständnis der Evolution der Tierentwicklung und -physiologie versetzt ^1,2. Nesseltiere werden in zwei Hauptgruppen eingeteilt: Anthozoen (z. B. Seeanemonen und Korallen) besitzen nur Planulalarven und sessilile Polypenstadien, während Medusozoa (Mitglieder von Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa und Cubozoa) typischerweise die Form von frei schwimmenden Medusen oder Quallen sowie Planulalarven und Polypen annehmen. Nesseltiere weisen häufig eine hohe Regenerationsfähigkeit auf, und ihre zugrunde liegenden zellulären Mechanismen, insbesondere ihr Besitz von adulten Stammzellen und proliferativen Zellen, haben viel Aufmerksamkeit erregt ^3,4. Ursprünglich in Hydra identifiziert, befinden sich hydrozoische Stammzellen in den interstitiellen Räumen zwischen ektodermalen Epithelzellen und werden allgemein als interstitielle Zellen oder i-Zellen bezeichnet³.

Hydrozoen-i-Zellen haben gemeinsame Merkmale, darunter Multipotenz, die Expression weit konservierter Stammzellmarker (z. B. Nanos, Piwi, Vasa) und Migrationspotenzial 3,5,6,7,8. Als funktionelle Stammzellen sind i-Zellen umfassend an der Entwicklung, Physiologie und Umweltreaktion von Hydrozoentieren beteiligt, was von ihrer hohen Regenerationsfähigkeit und Plastizität zeugt³. Während Stammzellen, ähnlich wie i-Zellen, außerhalb von Hydrozoen selbst bei der etablierten Modellart Nematostella nicht identifiziert wurden, sind proliferative Zellen immer noch an der Erhaltung und Regeneration von somatischem Gewebe sowie der Keimbahn^{beteiligt 9}. Da Studien zur Entwicklung und Regeneration von Nesseltieren überwiegend an polypartigen Tieren wie Hydra, Hydractinia und Nematostella durchgeführt wurden, bleiben die zelluläre Dynamik und Funktionen von Stammzellen in Quallenarten weitgehend unberücksichtigt.

Die Hydrozoenqualle Clytia hemisphaerica , eine kosmopolitische Quallenart mit verschiedenen Lebensräumen auf der ganzen Welt, einschließlich des Mittelmeers und Nordamerikas, wurde als experimentelles Modelltier in mehreren Entwicklungs- und Evolutionsstudien verwendet¹⁰. Mit seiner geringen Größe, einfachen Handhabung und großen Eiern eignet sich Clytia sowohl für die Laborpflege als auch für die Einführung genetischer Werkzeuge wie der kürzlich etablierten Transgenese- und Knockout-Methoden¹¹, was die Möglichkeit einer detaillierten Analyse der zellulären und molekularen Mechanismen eröffnet, die der Quallenbiologie zugrunde liegen. Im Clytia medusa-Tentakel sind i-Zellen in der proximalen Region, der sogenannten Zwiebel, lokalisiert, und Vorläuferzellen wie Nematoblasten wandern zur distalen Spitze, während sie sich in verschiedene Zelltypen differenzieren, einschließlich Nematozyten¹².

Während der Regeneration des Clytia manubrium, dem oralen Organ der Quallen, wandern Nanos1⁺ i-Zellen, die in den Gonaden vorhanden sind, in die Region, in der das Manubrium als Reaktion auf Schäden verloren geht, und nehmen an der Regeneration des Manubriums teil⁷. Diese Ergebnisse unterstützen die Idee, dass sich i-Zellen in Clytia auch als funktionelle Stammzellen verhalten, die an der Morphogenese und Regeneration beteiligt sind. Da sich die Eigenschaften von i-Zellen jedoch bei repräsentativen Tieren vom Polyp-Typ wie Hydra und Hydractinia³ unterscheiden, ist es möglich, dass die Eigenschaften und Funktionen von Stammzellen zwischen Quallenarten diversifiziert sind. Darüber hinaus waren mit Ausnahme von Clytia experimentelle Techniken für andere Quallen begrenzt, und die detaillierte Dynamik proliferativer Zellen und Stammzellen ist unbekannt¹³.

Die Hydrozoenqualle Cladonema pacificum ist ein aufstrebender Modellorganismus, der in einer Laborumgebung ohne Wasserpumpe oder Filtersystem gehalten werden kann. Die Cladonema medusa hat verzweigte Tentakel, ein häufiges Merkmal in der Cladonematidae-Familie, und ein Photorezeptororgan namens Ocellus auf der ektodermalen Schicht in der Nähe der Zwiebel¹⁴. Der Tentakelverzweigungsprozess findet an einer neuen Verzweigungsstelle statt, die entlang der adaxialen Seite des Tentakels erscheint. Im Laufe der Zeit verlängern sich die Tentakel weiter und verzweigen sich, wobei die älteren Zweige in Richtung der Spitze¹⁵ herausgeschoben werden. Darüber hinaus können sich Cladonema-Tentakel innerhalb weniger Tage nach Amputation regenerieren. Neuere Studien haben die Rolle von proliferierenden Zellen und stammähnlichen Zellen bei der Tentakelverzweigung und Regeneration bei Cladonema^16,17 vorgeschlagen. Während jedoch die konventionelle In-situ-Hybridisierung (ISH) verwendet wurde, um die Genexpression in Cladonema sichtbar zu machen, ist es aufgrund ihrer geringen Auflösung derzeit schwierig, die Stammzelldynamik auf zellulärer Ebene im Detail zu beobachten.

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Visualisierung stammartiger Zellen in Cladonema durch FISH und Co-Färbung mit EdU, einem Marker der Zellproliferation¹⁸. Wir visualisieren das Expressionsmuster von Nanos1, einem Stammzellmarker ^5,17, mittels FISH^, das die Identifizierung einer stammartigen Zellverteilung auf Einzelzellebene ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht die Co-Färbung der Nanos1-Expression mit EdU-Markierung, aktiv proliferierende stammartige Zellen zu unterscheiden. Diese Methode zur Überwachung sowohl stammähnlicher Zellen als auch proliferativer Zellen kann auf eine Vielzahl von Untersuchungsbereichen angewendet werden, einschließlich Tentakelverzweigung, Gewebehomöostase und Organregeneration bei Cladonema, und ein ähnlicher Ansatz kann auf andere Quallenarten angewendet werden.

Protocol

HINWEIS: Details zu allen Materialien, Reagenzien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle . 1. Sondensynthese RNA-ExtraktionLegen Sie drei lebende Cladonema-Medusen , die in künstlichem Meerwasser (ASW) kultiviert werden, in ein 1,5-ml-Röhrchen mit einer 3,1-ml-Transferpipette mit abgeschnittener Spitze und entfernen Sie so viel ASW wie möglich.HINWEIS: ASW wird hergestellt, in…

Representative Results

Cladonema-Tentakel wurden als Modell verwendet, um die zellulären Prozesse der Morphogenese und Regeneration zu untersuchen15,16,17. Die Tentakelstruktur besteht aus einer Epithelröhre, in der sich stammartige Zellen oder i-Zellen im proximalen Bereich befinden, der als Tentakelkolben bezeichnet wird, und neue Zweige werden sequentiell an der Rückseite der distalen Region der Birne entlang der adaxialen Seite hinzuge…

Discussion

Proliferierende Zellen und Stammzellen sind wichtige zelluläre Quellen in verschiedenen Prozessen wie Morphogenese, Wachstum und Regeneration^21,22. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Co-Färbung des Stammzellmarkers Nanos1 durch FISH- und EdU-Markierung in Cladonema medusae. Frühere Arbeiten mit EdU- oder BrdU-Markierung haben vorgeschlagen, dass proliferative Zellen in den Tentakelkolben^16,17 lokalisieren^,…

Materials

2-Mercaptoethanol	Wako	137-06862
3.1 mL transfer pipette	Thermo Scientific	233-20S
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)	Wako	029-15043
anti-DIG-POD	Roche	11207733910
Cladonema pacificum Nanos1 forward primer			5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3’
Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer			5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’
Cladonema pacificum Piwi forward primer			5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3’
Cladonema pacificum Piwi reverse primer			5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3’
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye	Invitrogen	C10337	EdU kit
Coroline off	GEX Co. ltd	N/A	chlorine neutralizer
DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent	Roche	11175041910	blocking buffer
DIG RNA labeling mix	Roche	11277073910
DTT	Promega	P117B
ECOS competent cell DH5α	NIPPON GENE	316-06233	competent cell
Fast gene Gel/PCR Extraction kit	Fast gene	FG-91302	gel extraction kit
Fast gene plasmid mini kit	Fast gene	FG-90502	plasmid miniprep
Formamide	Wako	068-00426
Heparin sodium salt from porcine	SIGMA-ALDRICH	H3393-10KU
Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG)	Wako	096-05143
LB Agar	Invitrogen	22700-025	agar plate
LB Broth Base	Invitrogen	12780-052	LB medium
Maleic acid	Wako	134-00495
mini Quick spin RNA columns	Roche	11814427001	clean-up column
NaCl	Wako	191-01665
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi	Thermo Scientific	ND-ONEC-W	spectrophotometer
Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20)	Wako	166-21115
PowerMasher 2	nippi	891300	homogenizer
Proteinase K	Nacarai Tesque	29442-14
RNase Inhibitor	TaKaRa	2313A
RNeasy Mini kit	Qiagen	74004	total RNA isolation kit
RQ1 RNase-Free Dnase	Promega	M6101
Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC)	TaKaRa	T9172
SEA LIFE	Marin Tech	N/A	mixture of mineral salts
T3 RNA polymerase	Roche	11031163001
T7 RNA polymerase	Roche	10881767001
TAITEC HB-100	TAITEC	0040534-000	Hybridization incuvator
TaKaRa Ex Taq	TaKaRa	RR001A	Taq DNA polymerase
TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit	TaKaRa	6210A	cDNA synthesis kit
Target Clone	TOYOBO	TAK101	pTA2 Vector
tRNA	Roche	10109541001
TSA Plus Cyanine 5	AKOYA Biosciences	NEL745001KT	tyramide signal amplification (TSA) technique
Zeiss LSM 880	ZEISS	N/A	laser scanning confocal microscope