Hidrozoan Denizanası Cladonema pacificum'daki Kök Benzeri Hücreler için Floresan In Situ Hibridizasyon ve 5-Etinil-2'-Deoksiüridin Etiketleme
Summary
Burada, denizanası Cladonema’daki kök benzeri çoğalan hücreleri görselleştirmek için bir protokol açıklıyoruz. Bir kök hücre belirteci ile tam montajlı floresan in situ hibridizasyon, kök benzeri hücrelerin tespit edilmesine izin verir ve 5-etinil-2′-deoksiüridin etiketlemesi, çoğalan hücrelerin tanımlanmasını sağlar. Birlikte, aktif olarak çoğalan kök benzeri hücreler tespit edilebilir.
Abstract
Deniz anemonları, mercanlar ve denizanası da dahil olmak üzere Cnidarian’lar, sapsız poliplerde ve serbest yüzme medusalarında ortaya çıkan çeşitli morfoloji ve yaşam tarzları sergilerler. Hydra ve Nematostella gibi yerleşik modellerde örneklendiği gibi, kök hücreler ve / veya proliferatif hücreler cnidarian poliplerin gelişimine ve yenilenmesine katkıda bulunur. Bununla birlikte, çoğu denizanasında, özellikle medusa aşamasında, altta yatan hücresel mekanizmalar büyük ölçüde belirsizdir ve bu nedenle, spesifik hücre tiplerini tanımlamak için sağlam bir yöntem geliştirmek kritik öneme sahiptir. Bu yazıda, hidrozoan denizanası Cladonema pacificum’daki kök benzeri çoğalan hücreleri görselleştirmek için bir protokol açıklanmaktadır. Cladonema medusae, yetişkin evreleri boyunca sürekli büyüyen ve rejeneratif kapasiteyi koruyan dallanmış dokunaçlara sahiptir ve çoğalan ve / veya kök benzeri hücreler tarafından düzenlenen hücresel mekanizmaları incelemek için eşsiz bir platform sağlar. Bir kök hücre belirteci kullanan tam montajlı floresan in situ hibridizasyon (FISH), kök benzeri hücrelerin tespit edilmesine izin verirken, bir S faz belirteci olan 5-etinil-2′-deoksiüridin (EdU) ile nabız etiketlemesi, çoğalan hücrelerin tanımlanmasını sağlar. Hem FISH hem de EdU etiketlemesini birleştirerek, sabit hayvanlar üzerinde aktif olarak çoğalan kök benzeri hücreleri tespit edebiliriz ve bu teknik, model olmayan denizanası türleri de dahil olmak üzere diğer hayvanlara geniş çapta uygulanabilir.
Introduction
Cnidaria, sinir ve kasları olan hayvanları içeren temel olarak dallanan bir metazoan filum olarak kabul edilir ve onları hayvan gelişiminin ve fizyolojisinin evrimini anlamak için benzersiz bir konuma yerleştirir 1,2. Cnidarians iki ana gruba ayrılır: Anthozoa (örneğin, deniz anemonları, mercanlar) sadece planula larvalarına ve sapsız polip aşamalarına sahipken, Medusozoa (Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa ve Cubozoa üyeleri) tipik olarak serbest yüzme medusae veya denizanası ile planula larvaları ve polipleri şeklini alır. Cnidarians genellikle yüksek rejeneratif kapasite sergiler ve altta yatan hücresel mekanizmaları, özellikle yetişkin kök hücrelere ve proliferatif hücrelere sahip olmaları, çok dikkat çekmiştir 3,4. Başlangıçta Hydra’da tanımlanan hidrozoan kök hücreler, ektodermal epitel hücreleri arasındaki interstisyel boşluklarda bulunur ve genellikle interstisyel hücreler veya i-hücreleri3 olarak adlandırılır.
Hidrozoan i-hücreleri, çok yönlülük, yaygın olarak korunan kök hücre belirteçlerinin ekspresyonu (örneğin, Nanolar, Piwi, Vasa) ve göç potansiyeli 3,5,6,7,8 gibi ortak özellikleri paylaşır. Fonksiyonel kök hücreler olarak, i-hücreler hidrozoan hayvanların gelişimine, fizyolojisine ve çevresel tepkilerine yoğun bir şekilde katılır ve bu da yüksek rejeneratif kapasitelerini ve plastisitelerini kanıtlar3. I-hücrelerine benzer kök hücreler, hidrozoanların dışında, yerleşik model türü Nematostella’da bile tanımlanmamış olsa da, proliferatif hücreler hala somatik dokunun ve germ hattı9’un bakımı ve yenilenmesinde rol oynamaktadır. Cnidarian gelişimi ve rejenerasyonu ile ilgili çalışmalar ağırlıklı olarak Hydra, Hydractinia ve Nematostella gibi polip tipi hayvanlar üzerinde yapıldığından, denizanası türlerinde kök hücrelerin hücresel dinamikleri ve işlevleri büyük ölçüde ele alınmamıştır.
Akdeniz ve Kuzey Amerika da dahil olmak üzere dünya çapında farklı habitatlara sahip kozmopolit bir denizanası türü olan hidrozoan denizanası Clytia hemisphaerica , çeşitli gelişimsel ve evrimsel çalışmalarda deneysel bir model hayvan olarak kullanılmıştır10. Küçük boyutu, kolay kullanımı ve büyük yumurtaları ile Clytia , laboratuar bakımı için ve yakın zamanda kurulan transgenez ve nakavt yöntemleri11 gibi genetik araçların tanıtılması için uygundur ve denizanası biyolojisinin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların ayrıntılı analizi için fırsat yaratır. Clytia medusa dokunaçlarında, i-hücreleri ampul adı verilen proksimal bölgede lokalize olur ve nematoblastlar gibi progenitörler, nematositler12 de dahil olmak üzere farklı hücre tiplerine farklılaşırken distal uca göç eder.
Denizanasının oral organı olan Clytia manubriumunun yenilenmesi sırasında, gonadlarda bulunan Nanos1 + i-hücreleri, hasara yanıt olarak manubriumun kaybolduğu bölgeye göç eder ve manubrium7’nin yenilenmesine katılır. Bu bulgular, Clytia’daki i-hücrelerinin aynı zamanda morfogenez ve rejenerasyonda rol oynayan fonksiyonel kök hücreler gibi davrandığı fikrini desteklemektedir. Bununla birlikte, i-hücrelerinin özelliklerinin Hydra ve Hydractinia 3 gibi temsili polip tipi hayvanlar arasında farklılık gösterdiği göz önüne alındığında, kök hücrelerin özelliklerinin ve işlevlerinin denizanası türleri arasında çeşitlendirilmesi mümkündür. Ayrıca, Clytia hariç, diğer denizanaları için deneysel teknikler sınırlandırılmıştır ve proliferatif hücrelerin ve kök hücrelerin ayrıntılı dinamikleri bilinmemektedir13.
Hidrozoan denizanası Cladonema pacificum, su pompası veya filtreleme sistemi olmadan laboratuvar ortamında tutulabilen yeni bir model organizmadır. Cladonema medusa, Cladonematidae ailesinde ortak bir özellik olan dallanmış dokunaçlara ve ampul14’ün yakınındaki ektodermal tabakada ocellus adı verilen bir fotoreseptör organına sahiptir. Dokunaç dallanma süreci, dokunaçların adaksiyal tarafı boyunca görünen yeni bir dallanma bölgesinde meydana gelir. Zamanla, dokunaçlar uzamaya ve dallanmaya devam eder, eski dallar uç15’e doğru itilir. Ek olarak, Cladonema dokunaçları amputasyondan sonra birkaç gün içinde yenilenebilir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, Cladonema16,17’de dokunaç dallanmasında ve rejenerasyonunda çoğalan hücrelerin ve kök benzeri hücrelerin rolünü ortaya koymuştur. Bununla birlikte, geleneksel in situ hibridizasyon (ISH), Cladonema’daki gen ekspresyonunu görselleştirmek için kullanılırken, düşük çözünürlüğü nedeniyle, kök hücre dinamiklerini hücresel düzeyde ayrıntılı olarak gözlemlemek şu anda zordur.
Bu yazıda Cladonema’daki kök benzeri hücrelerin FISH ile görselleştirilmesi ve hücre proliferasyonunun bir belirteci olan EdU ile birlikte boyanması için bir yöntem açıklanmaktadır18. Bir kök hücre belirteciolan 5,17 olan Nanos1’in ekspresyon paternini, tek hücre düzeyinde kök benzeri hücre dağılımının tanımlanmasına izin veren FISH tarafından görselleştiriyoruz. Ek olarak, Nanos1 ekspresyonunun EdU etiketlemesi ile birlikte boyanması, aktif olarak çoğalan kök benzeri hücrelerin ayırt edilmesini mümkün kılar. Hem kök benzeri hücreleri hem de proliferatif hücreleri izlemek için kullanılan bu yöntem, dokunaç dallanması, doku homeostazı ve Cladonema’da organ rejenerasyonu dahil olmak üzere çok çeşitli araştırma alanlarına uygulanabilir ve benzer bir yaklaşım diğer denizanası türlerine de uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Proliferasyon yapan hücreler ve kök hücreler morfogenez, büyüme ve rejenerasyon gibi çeşitli süreçlerde önemli hücresel kaynaklardır21,22. Bu yazıda kök hücre belirteci Nanos1’in Cladonema medusae’de FISH ve EdU etiketlemesi ile birlikte boyanması için bir yöntem açıklanmaktadır. EdU veya BrdU etiketlemesini kullanan önceki çalışmalar, proliferatif hücrelerin dokunaç ampulleri16,17’ye lokalize o…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma AMED tarafından JP22gm6110025 Hibe Numarası altında (YN’ye) ve JSPS KAKENHI Hibe Numarası 22H02762 (YN’ye) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Wako | 137-06862 | |
| 3.1 mL transfer pipette | Thermo Scientific | 233-20S | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Wako | 029-15043 | |
| anti-DIG-POD | Roche | 11207733910 | |
| Cladonema pacificum Nanos1 forward primer | 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3’ |
||
| Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer | 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’ | ||
| Cladonema pacificum Piwi forward primer | 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3’ |
||
| Cladonema pacificum Piwi reverse primer | 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3’ |
||
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen | C10337 | EdU kit |
| Coroline off | GEX Co. ltd | N/A | chlorine neutralizer |
| DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent | Roche | 11175041910 | blocking buffer |
| DIG RNA labeling mix | Roche | 11277073910 | |
| DTT | Promega | P117B | |
| ECOS competent cell DH5α | NIPPON GENE | 316-06233 | competent cell |
| Fast gene Gel/PCR Extraction kit | Fast gene | FG-91302 | gel extraction kit |
| Fast gene plasmid mini kit | Fast gene | FG-90502 | plasmid miniprep |
| Formamide | Wako | 068-00426 | |
| Heparin sodium salt from porcine | SIGMA-ALDRICH | H3393-10KU | |
| Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) | Wako | 096-05143 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | agar plate |
| LB Broth Base | Invitrogen | 12780-052 | LB medium |
| Maleic acid | Wako | 134-00495 | |
| mini Quick spin RNA columns | Roche | 11814427001 | clean-up column |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | spectrophotometer |
| Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | Wako | 166-21115 | |
| PowerMasher 2 | nippi | 891300 | homogenizer |
| Proteinase K | Nacarai Tesque | 29442-14 | |
| RNase Inhibitor | TaKaRa | 2313A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74004 | total RNA isolation kit |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | |
| Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) | TaKaRa | T9172 | |
| SEA LIFE | Marin Tech | N/A | mixture of mineral salts |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | |
| TAITEC HB-100 | TAITEC | 0040534-000 | Hybridization incuvator |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | Taq DNA polymerase |
| TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6210A | cDNA synthesis kit |
| Target Clone | TOYOBO | TAK101 | pTA2 Vector |
| tRNA | Roche | 10109541001 | |
| TSA Plus Cyanine 5 | AKOYA Biosciences | NEL745001KT | tyramide signal amplification (TSA) technique |
| Zeiss LSM 880 | ZEISS | N/A | laser scanning confocal microscope |
Referências
- Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157 (2017).
- Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire. Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).
- Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles. Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).
- Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria. Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).
- Leclère, L., et al. Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia. Biologia do Desenvolvimento. 364 (2), 236-248 (2012).
- Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata. eLife. 4, 05506 (2015).
- Sinigaglia, C., et al. Pattern regulation in a regenerating jellyfish. eLife. 9, 54868 (2020).
- David, C. N. Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making. The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).
- Röttinger, E. Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration. Cells. 10 (10), 2692 (2021).
- Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory. Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).
- Peron, S., Houliston, E., Leclère, L., Boutet, A., Shierwater, B. The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. , 129-147 (2021).
- Denker, E., Manuel, M., Leclère, L., Le Guyader, H., Rabet, N. Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria). Biologia do Desenvolvimento. 315 (1), 99-113 (2008).
- Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights. Genes. 12 (5), 758 (2021).
- Suga, H., et al. Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).
- Fujiki, A. Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria). Zoological Letters. 5 (12), 13 (2019).
- Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. PeerJ. 7, 7579 (2019).
- Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles. Development. 148 (23), (2021).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Angerer, L. M., Angerer, R. C. Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization. Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).
- Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (154), e60353 (2019).
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
- Penzo-Méndez, A. I., Stanger, B. Z. Organ-size regulation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240 (2015).
- Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Leclère, L. A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species. Biologia do Desenvolvimento. 434 (1), 15-23 (2018).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13 (1), 8 (2013).
- Flici, H., et al. An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian. Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).
- He, S., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).
- Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration. Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).
- Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Developmental Biology. 12 (1), 34 (2012).
- Gold, D. A., et al. Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1. PLoS One. 10 (8), 0134741 (2015).
- Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia. Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).
- Cheng, L. -. C., Alvarado, A. S. Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians. Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).
