يتم تقديم طرق لإعداد النيماتكس النشطة من الأنابيب الدقيقة ومحركات kinesin ، بما في ذلك تحضير البروتين وبنائه واستخدام الآبار للحبس النيماتيكي النشط.
أصبح تكوين المراحل النشطة القائمة على البوليمر الحيوي تقنية مهمة للباحثين المهتمين باستكشاف المجال الناشئ للبلورات السائلة النشطة وأدوارها المحتملة في بيولوجيا الخلية. تتكون هذه الأنظمة الجديدة من وحدات فرعية ذاتية القيادة تستهلك الطاقة محليا ، وتنتج سائلا ديناميكيا غير متوازن. لتشكيل المرحلة البلورية السائلة النشطة الموصوفة في هذا التقرير ، يتم الجمع بين مكونات البروتين المنقى بما في ذلك البوليمرات الحيوية والمحركات الجزيئية ، وتتشكل المرحلة النيماتيكية النشطة تلقائيا في وجود أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). لمراقبة الحالة النيماتيكية ، يجب أن تكون المادة محصورة في هندسة مناسبة للفحص المجهري بكثافة عالية بما يكفي. توضح هذه المقالة طريقتين مختلفتين لتشكيل مرحلة نيماتيكية نشطة باستخدام الأنابيب الدقيقة ومحركات كينيسين: تجميع طبقة نشطة ثنائية الأبعاد في واجهة زيت وماء وتجميع تحت طبقة زيت باستخدام بئر مرن. كما تم وصف تقنيات إدخال المادة الفعالة في آبار صغيرة بأشكال مختلفة.
تتكون السوائل النشطة من جزيئات أو عناصر مدفوعة بالطاقة تستمد الوقود من بيئتها المحلية. في ظل الظروف المناسبة ، يمكن لهذه العناصر النشطة المتحركة أن تعمل بشكل جماعي لإنتاج ديناميكيات السوائل الناشئة على نطاقات طول طويلة. هناك مجموعة متنوعة من الأمثلة على سلوك المرحلة غير المتوازنة في الأدبيات ويمكن العثور على المراحل النشطة عبر طيف الأنظمة الحية. بعض الأمثلة البارزة هي مستعمرات البكتيريا1 ، صفائح الخلايا 2,3 ، وتدفق أو سرب الكائنات الحية 4,5. كما تمت دراسة المراحل النشطة على نطاق واسع في المراحل المكثفة من خيوط الهيكل الخلوي ، إما كجزء من الخلية6 أو في الأنظمة الاصطناعية المصممة للاستفادة من المكونات المستخرجة بيولوجيا7،8،9. يعتبر الترتيب البلوري السائل وتشكيل العيوب الطوبولوجية في كل من الأنظمة التي تحدث بشكل طبيعي والاصطناعية المجمعة من المستخلصات البيولوجية ذات أهمية خاصة لمجتمع البحث. في السنوات الأخيرة ، درست مجموعات البحث مثل هذه الأنظمة ، وخصائصها الفيزيائية الأساسية ، وصلتها بالبيولوجيا2،3،10،11.
تركز هذه الورقة على تكوين الحالة النيماتيكية النشطة من مزيج من الأنابيب الدقيقة والبروتينات الحركية الكينيسينية. البلورة السائلة النيماتيكية التقليدية هي مرحلة توازن للمادة تظهر فيها الجزيئات المكونة ترتيبا اتجاهيا. على سبيل المثال ، قد يظهر سائل يتكون من جزيئات صلبة نسبيا تشبه القضيب كلا من الطور النيماتيكي ، وفي درجات الحرارة المرتفعة ، مائع غير موجه في المرحلة12. تم تطوير أول مثال تجريبي لمرحلة نيماتيكية نشطة بواسطة Sanchez et al.13 ، مع تكييف تجربة سابقة في المختبر 14 حيث تم استخدام مجموعات من البروتينات الحركية لإنتاج حركة قص بين حزم الأنابيب الدقيقة المجاورة. عندما اقتصر نظام الأنابيب الدقيقة هذا على طبقة رقيقة ، ظهر ترتيب نيماتيكي عفوي. في السنوات الأخيرة ، تمت دراسة الحالة النيماتيكية النشطة بشكل مكثف من قبل العديد من المجموعات البحثية التجريبية15,16 والنظرية 17,18 ، مع التركيز على ظواهر مثل الاضطراب النشط – وهي حالة ينتج فيها السائل تدفقات فوضوية ذاتية الحركة 19 – والعيوب الطوبولوجية المتنقلة. يصف هذا البحث طرق تحضير وتشكيل الحالة النيماتيكية النشطة من الأنابيب الدقيقة ومحركات الكينيسين في أشكال هندسية تجريبية مختلفة. أولا ، يتم وصف طرق التحضير لحلول المكونات المختلفة ، تليها طرق لتشكيل النيماتيكية النشطة باستخدام هندسين مختلفين لغرفة التدفق. يتم عرض نتائج التصوير النموذجية. أخيرا ، يتم وصف طرق حصر النيماتيك النشط في الآبار والقنوات.
هناك بعض النقاط في جميع أنحاء البروتوكولات التي يمكن للمجرب من خلالها إجراء بعض الفحوصات المهمة. قبل ملء أي من الجهازين بالمواد الفعالة ، يجب استخدام الفحص المجهري الفلوري (انظر الشكل 1) للتحقق من أن الأنابيب الدقيقة مبلمرة وطولها المثالي ~ 2-3 ميكرومتر. إذا لم تكن الأنابيب الدقيقة مرئية تحت المجهر ، فقد تكون قد أزيلت من البلمرة ولن تتشكل النيماتيكية النشطة. نظرا لأن الأنابيب الدقيقة الفردية صغيرة جدا ، فقد يكون من الصعب مراقبتها مباشرة من خلال المجهر. في هذه الدراسة ، تم استخدام كاميرا مضان عالية الجودة مصممة لتحدي تطبيقات الإضاءة المنخفضة مع البرنامج المرتبط للتحقق من نمو الفتيل. لا ينبغي أن تكون مجاميع الفلورسنت الكبيرة موجودة في هذه المرحلة ، لأن هذا قد يشير إلى إزالة البلمرة أو وجود بروتين مشوه. من الجيد أيضا عمل شريحة اختبار مجهر بسيطة من خلال الجمع بين الأنابيب الدقيقة و MIX و ATP بنفس النسب الموضحة في البروتوكولات. يجب أن يبدأ النشاط عند الجمع بين المكونات ويجب أن تبدو المادة مشابهة لتلك الموضحة في الشكل 2C مع وجود حزم وحركات خيوط ملحوظة مرئية في جميع الأنحاء.
عند استخدام طريقة خلية التدفق ، يكون وقت الطرد المركزي واتجاه خلية التدفق مهمين لتشكيل طبقة نشطة موحدة. قد تتطلب هذه الخطوة بعض الضبط الدقيق اعتمادا على نوع جهاز الطرد المركزي المستخدم. يعطي الطرد المركزي لخلية التدفق مع المستوى النشط الموجه بشكل عمودي على مستوى الدوران أفضل النتائج حيث يمكن دفع المواد إلى واجهة السوائل بشكل موحد. تحقق مرة أخرى من أن خلية التدفق محكمة الغلق بعناية قبل الطرد المركزي.
عند استخدام الطريقة المقلوبة لإنتاج نيماتات نشطة محصورة ، هناك عدة خطوات للتحسين. أولا ، من المهم استخدام طريقة طباعة 3D تنتج هياكل عالية الدقة. يمكن أن تتسبب الجدران الجانبية غير المستوية في التقاط الأنابيب الدقيقة ، مما يؤدي إلى تعطيل التدفقات. يجب ألا تكون الآبار عميقة جدا (تم استخدام آبار بعمق 150-200 ميكرومتر مع طبقة نفطية بسمك 2 مم في هذه الدراسة). قد يحتاج المجربون إلى ضبط هذه المعلمات قليلا عن طريق التجربة والخطأ للحصول على أفضل نتيجة.
تم استخدام طريقة خلية التدفق والطريقة المقلوبة من قبل مؤلفين مختلفين للنظر في مجموعة متنوعة من التأثيرات التي تؤثر على التدفقات النشطة ، بما في ذلك الزيوت المختلفة12 والهياكل المغمورة13. يعتمد اختيار الطريقة على الهدف التجريبي. باستخدام طريقة خلية التدفق ، يكون التصوير البصري من أعلى الطبقة النشطة أكثر وضوحا من الطريقة المقلوبة بسبب السوائل المختلفة التي تعلوها. في طريقة خلية التدفق ، يتم التصوير من خلال انزلاق غطاء زجاجي وطبقة رقيقة من الماء ، في حين تم تصميم الطريقة المقلوبة بحيث تكون طبقة الزيت في الأعلى. هذا يعني أن هناك حاجة إلى هدف مسافة عمل طويلة للطريقة المقلوبة ، ويتم تقليل جودة الصورة. يمكن ملاحظة اختلافات جودة الصورة من خلال مقارنة الشكل 2D (طريقة خلية التدفق) والشكل 3 (الطريقة المقلوبة) والفيلم 1 والفيلم 2 على التوالي. كانت هناك حاجة إلى عدسة تكبير أقل مع مسافة عمل أطول للشكل 3 من تلك المستخدمة في الشكل 2. يمكن تجنب عيوب التصوير هذه للطريقة المقلوبة إذا توفر مجهر مقلوب مناسب ، جنبا إلى جنب مع الأهداف مع مسافة عمل مناسبة لركائز شريحة المجهر. يمكن استخدام الزجاج الرقيق كركيزة للسماح باستخدام أهداف مسافة العمل القياسية.
كميزة ، تسمح الهندسة المقلوبة باستخدام مجموعة واسعة من لزوجة الزيت ، ولا تتطلب بالضرورة الطرد المركزي للدلو المتأرجح (إذا لم يكن ذلك متاحا) ، ويكون إعداد النظام أسهل نسبيا بمجرد إعداد القالب. ومع ذلك ، بالنسبة للحبس في الآبار باستخدام الطريقة المقلوبة ، قد يكون بعض الطرد المركزي مهما للحصول على المادة في طبقة 2D محددة جيدا.
تم استخدام طريقة خلية التدفق مؤخرا بنجاح كبير في التجارب التي تتطلب طبقة نشطة مستمرة. نظر عملنا الأخير في ديناميكيات العيوب الطوبولوجية في الطبقة النشطة ، حيث يكون التصوير عالي الجودة وتحليل النسيج مهما19. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام طريقة خلية التدفق للتحقيق في تأثيرات الهياكل المجهرية المغمورة بالزيت على التدفقات النشطة16 والأعمدة لاحتجاز العيوب في التدفقات النشطة31. تعمل هذه الطريقة بشكل جيد للغاية لتشكيل طبقة نشطة مستمرة ، وجودة الصورة ممتازة. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب تنفيذ خطوة الطرد المركزي المستخدمة لإنتاج الطبقة النشطة 2D النهائية ، وخلايا التدفق عرضة للتسريبات وفقاعات الهواء. الطريقة المقلوبة هي بديل مفيد للغاية مع معدل نجاح مرتفع ، وسهلة البناء ، ويمكن استخدامها لأي نمط ركيزة أو هندسة بشرط إنشاء قالب رئيسي مطبوع 3D عالي الدقة. هذه الطريقة مفيدة أيضا للنظر في آثار الحبس الهندسي على الديناميات النيماتيكية النشطة لأنها تجعل ملء الآبار أمرا بسيطا نسبيا.
في هذا البحث ، تم وصف طريقتين لتشكيل نيماتيكي نشط من الأنابيب الدقيقة ومحركات كينيسين ، بالإضافة إلى تقنية لحصر المواد في الآبار. يمثل النظام المقدم أنظف مثال على مرحلة نيماتيكية نشطة حاليا في الأدبيات وقد تم استنساخه من قبل عدة مجموعات حول العالم. لا تكمن أهمية هذه المادة في الأصول البيولوجية لمكوناتها فحسب ، بل أيضا لأنها تفتح اتجاها جديدا تماما في السوائل المرتبة النشطة. من خلال العمل مع هذا النظام وتوضيح خصائصه الأساسية ، يمكن للعلماء التحرك نحو تصميم مراحل نشطة اصطناعية بالكامل.
التجارب التي تركز على آثار الحبس على النيماتكس النشطة لديها القدرة على الإجابة على الأسئلة الأساسية المتعلقة بسلوك التدفقات النشطة وديناميكيات العيوب الطوبولوجية في ظل الحبس الطوبولوجي. ستساعد الطريقة المقدمة هنا في أداء مجموعة متنوعة من التجارب التي تركز على الهندسة وتحليلها ، بما في ذلك الموائع الدقيقة والخلط النشط.
The authors have nothing to disclose.
يود المؤلفون الاعتراف بجائزة المؤسسة الوطنية للعلوم (NSF) DMR-1808926 للتمويل السخي. كما تم دعم المشروع من قبل NSF من خلال مركز التميز البحثي في العلوم والتكنولوجيا: مركز الآلات الخلوية والجزيئية الحيوية في جامعة كاليفورنيا ميرسيد (HRD-1547848) ومركز برانديز لأبحاث المواد الحيوية (DMR-2011486). نود أن نشكر الدكتور بن ليو في جامعة كاليفورنيا ميرسيد للمساعدة في طباعة القالب 3D ، والدكتور جوردي إيجنيس على المشورة العلمية أثناء تطوير الطريقة التجريبية المقلوبة.
20 kD PEG (polyethylene glycol)) | Sigma Aldrich | 1419109 | Depletion agent CAS Number: 125061-88-3 |
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | M6514-50ML | CAS Number: 2530-85-0 |
3D printer & Resin | Phrozen | Phrozen sonic mini 8K 3D printer – Aqua Gray 8K resin | |
40% Acrylamide Solution | BIO-RAD | 1610140 | CAS Number: 7732-18-5, 79-06-1 |
Acetic Acid | Fisher | CAS Number: 64-19-7 | |
Acetone | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-64-1 | |
Adhesive sheets (NOTE: "Parafilm" is an alternative) | Grace Bio-Labs | 620001 | SecureSeal |
Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | CAS Number: 7727-54-0 |
Aquapel (NOTE: "RainX" is an alternative) | Aquapel Glass Treatment | hydrophobic glass treatment | |
ATP (Adenosine triphosphate) | Sigma Aldrich | A1852 | CAS Number: 34369-07-8 |
Beakers | VWR | ||
Catalase | Sigma Aldrich | C9322 | CAS Number: "9001-05-2" |
Desiccator | Bel-art | ||
Digital CMOS camera | Hamamatsu | ORCA – Flash4.0 LT+ | |
DTT (Dithiothreitol) | Sigma Aldrich | D9779 | CAS Number: "3483-12-3" |
EGTA (3,12-bis(carboxymethyl)-6,9-dioxa-3,12-diazatetradecane-1,14-dioic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00004291 | CAS Number: 67-42-5 |
Ethanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 64-17-5 | |
Fluorescence microscope | Leica | DM 2500P | |
Glass Coverslips | VWR | 48368-040 | |
Glass Slides | VWR | 16004-430 | |
Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | CAS Number: 50-99-7 |
Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | 345386 | CAS Number: 9001-37-0 |
GMPCPP (guanylyl 5'-α,β-methylenediphosphonate) | Jena Bioscience | NU-405S | CAS Number: 14997-54-7 |
HFE7500 Oil | 3M | ||
Hot Plate | Fisher Scientific | Thermix hot plate model 100M | |
Isopropyl Alcohol | VWR | ||
KCl (potassium chloride) | Sigma Aldrich | P5405 | CAS Number: 7447-40-7 |
Methanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-56-1 | |
MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma Aldrich | 208337 | CAS Number: 7786-30-3 |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf – Thermo Fisher | 1.5 mL | |
Nanopure water purifier | Sartorius | arium mini | |
NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma Aldrich | SX0603 | CAS Number: 1310-73-2 |
Petri Dishes | VWR | ||
PH Meter | Thermo Scientist | Orion 3 STAR | |
Phosphoenol-pyruvate (PEP) | Sigma Aldrich | MFCD00044476 | CAS Number: 4265-07-0 |
PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid) | Sigma Aldrich | CAS Number: 5625-37-6 | |
Pipettes (0.2 – 1000 µl) | VWR | ||
Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 2594628 | |
RAN Surfactant (NOTE: "FluoSurf" from Emulso is an alternative) | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
Silicon Oil (100mpa s-1000 mpa s) | Sigma Aldrich | CAS Number: 63148-52-7 | |
Streptavidin | Thermofisher | S888 | |
Swinging Bucket Centrifuge | Thermo Scientist | Sorvall legend RT+ | |
Sylgard 184 Elastomer base | World Precision Instruments | SYLG184 | |
Sylgard 184 Elastomer Curing agent | World Precision Instruments | SYLG184 | |
Table top centrifuge | Eppendorf | MiniSpin Plus | |
TEMED (Tetramethylethylenediamine) | BIO-RAD | 1610800 | CAS Number: 110-18-9 |
Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00006846 | CAS Number: 53188-07-1 |
Tubulin | Cytoskeleton | T240-B | |
Tubulin (Rhodamine labeled) | Cytoskeleton | TL590M-A | |
Ultracentrifuge | Beckman | Optima Max-TL | |
UV Light | RapidFix | ||
UV-curable glue (NOTE: "Norland NO81" is an alternative) | RapidFix | ||
Water Bath | Thelco | ||
Whatman Filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001325 |