Præsenteret her er metoder til fremstilling af aktiv nematik fra mikrotubuli og kinesinmotorer, herunder proteinforberedelse og konstruktion og anvendelse af brønde til aktiv nematisk indeslutning.
Dannelsen af biopolymerbaserede aktive faser er blevet en vigtig teknik for forskere, der er interesserede i at udforske det nye felt af aktive flydende krystaller og deres mulige roller i cellebiologi. Disse nye systemer består af selvdrevne underenheder, der forbruger energi lokalt og producerer en dynamisk væske uden for ligevægt. For at danne den aktive flydende krystalfase, der er beskrevet i denne rapport, kombineres oprensede proteinkomponenter, herunder biopolymerer og molekylære motorer, og den aktive nematiske fase dannes spontant i nærvær af adenosintrifosfat (ATP). For at observere den nematiske tilstand skal materialet indesluttes i en passende geometri til mikroskopi ved en høj nok densitet. Denne artikel beskriver to forskellige metoder til dannelse af en aktiv nematisk fase ved hjælp af mikrotubuli og kinesinmotorer: samling af et todimensionelt aktivt lag ved en olie- og vandgrænseflade og samling under et olielag ved hjælp af en elastomerisk brønd. Teknikker til at indsætte det aktive materiale i små brønde af forskellige former er også beskrevet.
Aktive væsker er sammensat af energidrevne partikler eller elementer, der trækker brændstof fra deres lokale miljø. Under de rette forhold kan disse bevægelige aktive elementer virke kollektivt for at producere emergent væskedynamik over lange længdeskalaer. Der er en række eksempler på en sådan uligevægtsfaseadfærd i litteraturen, og aktive faser kan findes på tværs af spektret af levende systemer. Nogle bemærkelsesværdige eksempler er kolonier af bakterier1, celleark2,3 og flokke eller sværmning af organismer 4,5. Aktive faser er også blevet undersøgt grundigt i kondenserede faser af cytoskeletale filamenter, enten som en del af celle6 eller i syntetiske systemer designet til at gøre brug af biologisk ekstraherede komponenter 7,8,9. Flydende krystallinsk orden og dannelse af topologiske defekter i både naturligt forekommende og syntetiske systemer samlet fra biologiske ekstrakter er af særlig interesse for forskersamfundet. I de senere år har forskergrupper undersøgt sådanne systemer, deres grundlæggende fysiske egenskaber og deres relevans for biologi 2,3,10,11.
Dette papir fokuserer på dannelsen af den aktive nematiske tilstand fra en kombination af mikrotubuli og kinesinmotorproteiner. Den traditionelle nematiske flydende krystal er en ligevægtsfase af stof, hvor de bestanddele molekyler udviser orienteringsordre. For eksempel kan en væske bestående af relativt stive stanglignende molekyler udvise både den nematiske fase og ved højere temperaturer en uorienteret isotrop væskefase12. Det første eksperimentelle eksempel på en aktiv nematisk fase blev udviklet af Sanchez et al.13 og tilpassede et tidligere in vitro-eksperiment 14, hvor klynger af motorproteiner blev brugt til at producere en forskydningsbevægelse mellem nærliggende mikrotubulusbundter. Da dette mikrotubulussystem var begrænset til et tyndt lag, opstod spontan nematisk orden. I de senere år er den aktive nematiske tilstand blevet studeret intensivt af flere eksperimentelle 15,16 og teoretiske 17,18 forskningsgrupper, der fokuserer på fænomener som aktiv turbulens – en tilstand, hvor væsken producerer selvdrevne kaotiske strømme 19 – og mobile topologiske defekter. Dette papir beskriver metoder til at forberede og danne den aktive nematiske tilstand fra mikrotubuli og kinesinmotorer i forskellige eksperimentelle geometrier. Først beskrives forberedelsesmetoder for de forskellige komponentopløsninger efterfulgt af metoder til dannelse af den aktive nematik ved hjælp af to forskellige flowkammergeometrier. Typiske billeddannelsesresultater vises. Endelig beskrives metoder til begrænsning af den aktive nematik i brønde og kanaler.
Der er et par punkter i protokollerne, hvor eksperimentatoren kan foretage nogle vigtige kontroller. Før en af anordningerne fyldes med aktivt materiale, skal fluorescensmikroskopi (se figur 1) bruges til at kontrollere, at mikrotubuli er polymeriseret og ideelt ~ 2-3 μm i længden. Hvis mikrotubuli ikke er synlige under mikroskopet, kan de have depolymeriseret, og den aktive nematiske dannes ikke. Fordi individuelle mikrotubuli er meget små, kan det være udfordrende at observere dem direkte gennem mikroskopet. I denne undersøgelse blev et fluorescenskamera af høj kvalitet designet til udfordrende applikationer med svagt lys brugt med den tilhørende software til at verificere filamentvækst. Signifikante fluorescerende aggregater bør ikke være til stede på dette stadium, da dette kan indikere depolymerisering eller tilstedeværelsen af denatureret protein. Det er også en god ide at lave et simpelt mikroskoptestglas ved at kombinere mikrotubuli, MIX og ATP i de samme forhold som beskrevet i protokollerne. Aktiviteten skal begynde med at kombinere komponenterne, og materialet skal se ud som vist i figur 2C med bundter til stede og mærkbare filamentbevægelser synlige hele vejen igennem.
Ved anvendelse af flowcellemetoden er centrifugetiden og orienteringen af flowcellen vigtig for dannelsen af et ensartet aktivt lag. Dette trin kan kræve en vis finjustering afhængigt af den anvendte centrifugetype. Centrifugering af flowcellen med det aktive plan orienteret vinkelret på rotationsplanet giver de bedste resultater, da materiale kan skubbes ensartet ind på væskegrænsefladen. Dobbelttjek, at flowcellen er omhyggeligt forseglet, før den centrifugeres.
Når du bruger den omvendte metode til at producere begrænset aktiv nematik, er der flere trin til optimering. For det første er det vigtigt at bruge en 3D-printmetode, der producerer strukturer med høj opløsning. Ujævne sidevægge kan få mikrotubuli til at fange, hvilket vil forstyrre strømmene. Brøndene bør ikke være for dybe (150-200 μm dybe brønde med et 2 mm tykt overliggende olielag blev brugt i denne undersøgelse). Eksperimenter skal muligvis justere disse parametre lidt ved forsøg og fejl for at få det bedste resultat.
Flowcellemetoden og den omvendte metode er blevet brugt af forskellige forfattere til at se på en række effekter, der påvirker de aktive strømme, herunder forskellige olier12 og nedsænkede strukturer13. Valget af metode afhænger af det eksperimentelle mål. Ved hjælp af flowcellemetoden er optisk billeddannelse ovenfra det aktive lag klarere end for den omvendte metode på grund af de forskellige overliggende væsker. I flowcellemetoden udføres billeddannelse gennem en glasdækselslip og et tyndt lag vand, mens den omvendte metode er designet til at have olielaget ovenpå. Det betyder, at der er behov for et langdistancemål for den omvendte metode, og billedkvaliteten reduceres. Forskelle i billedkvalitet kan ses ved at sammenligne figur 2D (flowcellemetode) og figur 3 (omvendt metode) og film 1 og film 2. Der kræves et lavere forstørrelsesglas med en længere arbejdsafstand for figur 3 end det, der blev brugt til figur 2. Disse billeddannelsesulemper for den omvendte metode kan undgås, hvis der findes et passende omvendt mikroskop kombineret med mål med en passende arbejdsafstand for mikroskopets diasunderlag. Tyndere glas kan bruges som et underlag for at muliggøre brugen af standard arbejdsdistancemål.
Som en fordel giver den omvendte geometri mulighed for anvendelse af et bredere udvalg af olieviskositeter, kræver ikke nødvendigvis svingende spandcentrifugering (hvis dette ikke er tilgængeligt), og forberedelse af systemet er relativt lettere, når formen er forberedt. Ved indeslutning i brønde ved hjælp af den omvendte metode kan en vis centrifugering dog være vigtig for at få materialet ind i et veldefineret 2D-lag.
Flowcellemetoden er for nylig blevet brugt med stor succes i eksperimenter, hvor der kræves et kontinuerligt aktivt lag. Vores seneste arbejde har set på dynamikken i topologiske defekter i det aktive lag, hvor billeddannelse og teksturanalyse af høj kvalitet er vigtig19. Derudover er flowcellemetoden blevet brugt til at undersøge virkningerne af olienedsænkede mikrostrukturer på aktive strømme16 og søjler for at fange defekter i de aktive strømme31. Denne metode fungerer meget godt til dannelse af et kontinuerligt aktivt lag, og billedkvaliteten er fremragende. Imidlertid kan centrifugeringstrinnet, der bruges til at producere det endelige 2D-aktive lag, være vanskeligt at udføre, og flowcellerne er tilbøjelige til lækager og luftbobler. Den omvendte metode er et meget nyttigt alternativ med en høj succesrate, er let at konstruere og kan bruges til ethvert substratmønster eller geometri, forudsat at der kan oprettes en 3D-printet masterform i høj opløsning. Denne metode er også nyttig til at se på virkningerne af geometrisk indeslutning på aktiv nematisk dynamik, fordi den gør påfyldningsbrønde relativt ligetil.
I dette papir beskrives to måder at danne en aktiv nematik fra mikrotubuli og kinesinmotorer plus en teknik til at begrænse materialerne i brønde. Det præsenterede system repræsenterer det reneste eksempel på en aktiv nematisk fase, der i øjeblikket er i litteraturen og er blevet gengivet af flere grupper rundt om i verden. Betydningen af dette materiale ligger ikke kun i den biologiske oprindelse af dets komponenter, men også fordi det åbner en helt ny retning i aktive ordnede væsker. Ved at arbejde med dette system og belyse dets grundlæggende egenskaber kan forskere bevæge sig mod design af fuldsyntetiske aktive faser.
Eksperimenterne fokuserede på virkningerne af indeslutning på aktiv nematik har potentialet til at besvare grundlæggende spørgsmål vedrørende aktive strømmes opførsel og topologisk defektdynamik under topologisk indeslutning. Metoden, der præsenteres her, vil hjælpe med udførelsen af en række geometrifokuserede eksperimenter og deres analyse, herunder mikrofluidik og aktiv blanding.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende National Science Foundation (NSF) -prisen DMR-1808926 for generøs finansiering. Projektet blev også støttet af NSF gennem Center of Research Excellence in Science and Technology: Center for Cellular and Biomolecular Machines ved University of California Merced (HRD-1547848) og Brandeis Biomaterials Facility Materials Research Science and Engineering Center (DMR-2011486). Vi vil gerne takke Dr. Bin Liu ved University of California Merced for hjælp til 3D-udskrivning af formen og Dr. Jordi Ignes for videnskabelig rådgivning under udviklingen af den omvendte eksperimentelle metode.
20 kD PEG (polyethylene glycol)) | Sigma Aldrich | 1419109 | Depletion agent CAS Number: 125061-88-3 |
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | M6514-50ML | CAS Number: 2530-85-0 |
3D printer & Resin | Phrozen | Phrozen sonic mini 8K 3D printer – Aqua Gray 8K resin | |
40% Acrylamide Solution | BIO-RAD | 1610140 | CAS Number: 7732-18-5, 79-06-1 |
Acetic Acid | Fisher | CAS Number: 64-19-7 | |
Acetone | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-64-1 | |
Adhesive sheets (NOTE: "Parafilm" is an alternative) | Grace Bio-Labs | 620001 | SecureSeal |
Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | CAS Number: 7727-54-0 |
Aquapel (NOTE: "RainX" is an alternative) | Aquapel Glass Treatment | hydrophobic glass treatment | |
ATP (Adenosine triphosphate) | Sigma Aldrich | A1852 | CAS Number: 34369-07-8 |
Beakers | VWR | ||
Catalase | Sigma Aldrich | C9322 | CAS Number: "9001-05-2" |
Desiccator | Bel-art | ||
Digital CMOS camera | Hamamatsu | ORCA – Flash4.0 LT+ | |
DTT (Dithiothreitol) | Sigma Aldrich | D9779 | CAS Number: "3483-12-3" |
EGTA (3,12-bis(carboxymethyl)-6,9-dioxa-3,12-diazatetradecane-1,14-dioic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00004291 | CAS Number: 67-42-5 |
Ethanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 64-17-5 | |
Fluorescence microscope | Leica | DM 2500P | |
Glass Coverslips | VWR | 48368-040 | |
Glass Slides | VWR | 16004-430 | |
Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | CAS Number: 50-99-7 |
Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | 345386 | CAS Number: 9001-37-0 |
GMPCPP (guanylyl 5'-α,β-methylenediphosphonate) | Jena Bioscience | NU-405S | CAS Number: 14997-54-7 |
HFE7500 Oil | 3M | ||
Hot Plate | Fisher Scientific | Thermix hot plate model 100M | |
Isopropyl Alcohol | VWR | ||
KCl (potassium chloride) | Sigma Aldrich | P5405 | CAS Number: 7447-40-7 |
Methanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-56-1 | |
MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma Aldrich | 208337 | CAS Number: 7786-30-3 |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf – Thermo Fisher | 1.5 mL | |
Nanopure water purifier | Sartorius | arium mini | |
NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma Aldrich | SX0603 | CAS Number: 1310-73-2 |
Petri Dishes | VWR | ||
PH Meter | Thermo Scientist | Orion 3 STAR | |
Phosphoenol-pyruvate (PEP) | Sigma Aldrich | MFCD00044476 | CAS Number: 4265-07-0 |
PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid) | Sigma Aldrich | CAS Number: 5625-37-6 | |
Pipettes (0.2 – 1000 µl) | VWR | ||
Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 2594628 | |
RAN Surfactant (NOTE: "FluoSurf" from Emulso is an alternative) | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
Silicon Oil (100mpa s-1000 mpa s) | Sigma Aldrich | CAS Number: 63148-52-7 | |
Streptavidin | Thermofisher | S888 | |
Swinging Bucket Centrifuge | Thermo Scientist | Sorvall legend RT+ | |
Sylgard 184 Elastomer base | World Precision Instruments | SYLG184 | |
Sylgard 184 Elastomer Curing agent | World Precision Instruments | SYLG184 | |
Table top centrifuge | Eppendorf | MiniSpin Plus | |
TEMED (Tetramethylethylenediamine) | BIO-RAD | 1610800 | CAS Number: 110-18-9 |
Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00006846 | CAS Number: 53188-07-1 |
Tubulin | Cytoskeleton | T240-B | |
Tubulin (Rhodamine labeled) | Cytoskeleton | TL590M-A | |
Ultracentrifuge | Beckman | Optima Max-TL | |
UV Light | RapidFix | ||
UV-curable glue (NOTE: "Norland NO81" is an alternative) | RapidFix | ||
Water Bath | Thelco | ||
Whatman Filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001325 |