यहां प्रस्तुत सूक्ष्मनलिकाएं और काइन्सिन मोटर्स से सक्रिय नेमैटिक्स तैयार करने के तरीके हैं, जिसमें प्रोटीन तैयार करना और निर्माण और सक्रिय नेमेटिक कारावास के लिए कुओं का उपयोग शामिल है।
बायोपॉलीमर-आधारित सक्रिय चरणों का गठन सक्रिय तरल क्रिस्टल के उभरते क्षेत्र और सेल जीव विज्ञान में उनकी संभावित भूमिकाओं की खोज में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक बन गया है। इन नवीन प्रणालियों में स्व-संचालित उप-इकाइयाँ शामिल हैं जो स्थानीय रूप से ऊर्जा का उपभोग करती हैं, जो संतुलन से बाहर गतिशील तरल पदार्थ का उत्पादन करती हैं। इस रिपोर्ट में वर्णित सक्रिय तरल क्रिस्टल चरण बनाने के लिए, बायोपॉलिमर और आणविक मोटर्स सहित शुद्ध प्रोटीन घटकों को जोड़ा जाता है, और सक्रिय नेमेटिक चरण अनायास एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) की उपस्थिति में बनता है। नेमेटिक अवस्था का निरीक्षण करने के लिए, सामग्री को उच्च पर्याप्त घनत्व पर माइक्रोस्कोपी के लिए एक उपयुक्त ज्यामिति में सीमित किया जाना चाहिए। यह लेख सूक्ष्मनलिकाएं और काइन्सिन मोटर्स का उपयोग करके एक सक्रिय नेमेटिक चरण के गठन के लिए दो अलग-अलग तरीकों का वर्णन करता है: एक तेल और पानी के इंटरफ़ेस पर दो आयामी सक्रिय परत की असेंबली और एक इलास्टोमेरिक कुएं का उपयोग करके एक तेल परत के नीचे असेंबली। विभिन्न आकृतियों के छोटे कुओं में सक्रिय सामग्री डालने की तकनीकों का भी वर्णन किया गया है।
सक्रिय तरल पदार्थ ऊर्जा संचालित कणों या तत्वों से बने होते हैं जो अपने स्थानीय वातावरण से ईंधन खींचते हैं। सही परिस्थितियों में, ये मोटिव सक्रिय तत्व लंबी लंबाई-तराजू पर आकस्मिक द्रव गतिशीलता का उत्पादन करने के लिए सामूहिक रूप से कार्य कर सकते हैं। साहित्य में इस तरह के आउट-ऑफ-संतुलन चरण व्यवहार के कई उदाहरण हैं और सक्रिय चरण जीवित प्रणालियों के स्पेक्ट्रम में पाए जा सकते हैं। कुछ उल्लेखनीय उदाहरण बैक्टीरिया1 की कॉलोनियां, सेल शीट 2,3, और जीवों के झुंड या गर्म करने वाले 4,5 हैं। साइटोस्केलेटल फिलामेंट्स के संघनित चरणों में सक्रिय चरणों का भी बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, या तो सेल6 के हिस्से के रूप में या जैविक रूप से निकाले गए घटकों 7,8,9 का उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किए गए सिंथेटिक सिस्टम में। तरल क्रिस्टलीय आदेश और जैविक अर्क से इकट्ठे प्राकृतिक रूप से होने वाले और सिंथेटिक सिस्टम दोनों में टोपोलॉजिकल दोषों का गठन अनुसंधान समुदाय के लिए विशेष रुचि रखता है। हाल के वर्षों में, अनुसंधान समूहों ने ऐसी प्रणालियों, उनके मौलिक भौतिक गुणों और जीव विज्ञान 2,3,10,11 के लिए उनकी प्रासंगिकता की जांच की है।
यह पेपर सूक्ष्मनलिकाएं और काइन्सिन मोटर प्रोटीन के संयोजन से सक्रिय नेमेटिक अवस्था के गठन पर केंद्रित है। पारंपरिक नेमेटिक तरल क्रिस्टल पदार्थ का एक संतुलन चरण है जिसमें घटक अणु अभिविन्यास क्रम प्रदर्शित करते हैं। उदाहरण के लिए, अपेक्षाकृत कठोर रॉड जैसे अणुओं से युक्त एक तरल पदार्थ नेमेटिक चरण और उच्च तापमान पर, एक अनओरिएंटेड आइसोट्रोपिक द्रव चरण12 दोनों का प्रदर्शन कर सकता है। एक सक्रिय नेमेटिक चरण का पहला प्रयोगात्मक उदाहरण सांचेज एट अल .13 द्वारा विकसित किया गया था, जो पहले के इन विट्रो प्रयोग14 को अनुकूलित करता था जिसमें मोटर प्रोटीन के समूहों का उपयोग पड़ोसी सूक्ष्मनलिका बंडलों के बीच एक कतरनी गति उत्पन्न करने के लिए किया गया था। जब यह सूक्ष्मनलिका प्रणाली एक पतली परत तक ही सीमित थी, तो सहज नेमेटिक ऑर्डरिंग उभरी। हाल के वर्षों में, सक्रिय न्यूमैटिक स्थिति का कई प्रयोगात्मक15,16 और सैद्धांतिक17,18 शोध समूहों द्वारा गहन अध्ययन किया गया है, जो सक्रिय अशांति जैसी घटनाओं पर ध्यान केंद्रित करता है – एक ऐसी स्थिति जिसमें तरल पदार्थ स्व-संचालित अराजक प्रवाह पैदा करता है19 – और मोबाइल टोपोलॉजिकल दोष। यह पेपर विभिन्न प्रयोगात्मक ज्यामिति में सूक्ष्मनलिकाएं और काइन्सिन मोटर्स से सक्रिय नेमेटिक स्थिति तैयार करने और बनाने के तरीकों का वर्णन करता है। सबसे पहले, विभिन्न घटक समाधानों के लिए तैयारी के तरीकों का वर्णन किया गया है, इसके बाद दो अलग-अलग प्रवाह कक्ष ज्यामिति का उपयोग करके सक्रिय नेमेटिक बनाने के तरीके हैं। विशिष्ट इमेजिंग परिणाम दिखाए गए हैं। अंत में, कुओं और चैनलों में सक्रिय नेमेटिक को सीमित करने के तरीकों का वर्णन किया गया है।
प्रोटोकॉल में कुछ बिंदु हैं जिन पर प्रयोगकर्ता कुछ महत्वपूर्ण जांच कर सकता है। सक्रिय सामग्री के साथ किसी भी उपकरण को भरने से पहले, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी ( चित्रा 1 देखें) का उपयोग यह जांचने के लिए किया जाना चाहिए कि सूक्ष्मनलिकाएं बहुलक हैं और आदर्श रूप से ~ 2-3 μm लंबाई में हैं। यदि सूक्ष्मनलिकाएं माइक्रोस्कोप के नीचे दिखाई नहीं देती हैं, तो वे डिपोलीमराइज्ड हो सकते हैं और सक्रिय नेमेटिक नहीं बनेंगे। क्योंकि व्यक्तिगत सूक्ष्मनलिकाएं बहुत छोटी होती हैं, इसलिए माइक्रोस्कोप के माध्यम से उन्हें सीधे निरीक्षण करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इस अध्ययन में, चुनौतीपूर्ण कम रोशनी वाले अनुप्रयोगों के लिए डिज़ाइन किए गए एक उच्च गुणवत्ता वाले फ्लोरेसेंस कैमरा का उपयोग फिलामेंट विकास को सत्यापित करने के लिए संबंधित सॉफ़्टवेयर के साथ किया गया था। इस स्तर पर महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट समुच्चय मौजूद नहीं होना चाहिए, क्योंकि यह डिपोलीमराइजेशन या विकृत प्रोटीन की उपस्थिति का संकेत दे सकता है। प्रोटोकॉल में वर्णित अनुपात में सूक्ष्मनलिकाएं, मिक्स और एटीपी को जोड़कर एक सरल माइक्रोस्कोप परीक्षण स्लाइड बनाना भी एक अच्छा विचार है। गतिविधि घटकों के संयोजन पर शुरू होनी चाहिए और सामग्री को चित्रा 2 सी में दिखाए गए बंडलों के समान दिखाई देना चाहिए जिसमें बंडल मौजूद हैं और ध्यान देने योग्य फिलामेंट आंदोलन पूरे समय दिखाई देते हैं।
प्रवाह सेल विधि का उपयोग करते समय, प्रवाह सेल का सेंट्रीफ्यूज समय और अभिविन्यास एक समान सक्रिय परत के गठन के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस चरण में उपयोग किए गए सेंट्रीफ्यूज प्रकार के आधार पर कुछ ठीक ट्यूनिंग की आवश्यकता हो सकती है। घूर्णन के तल के लंबवत सक्रिय विमान उन्मुख के साथ प्रवाह सेल को सेंट्रीफ्यूज करना सबसे अच्छे परिणाम देता है क्योंकि सामग्री को समान रूप से द्रव इंटरफ़ेस पर धकेला जा सकता है। सेंट्रीफ्यूजिंग से पहले फ्लो सेल को सावधानीपूर्वक सील किया गया है, इसकी दोबारा जांच करें।
सीमित सक्रिय नेमैटिक्स का उत्पादन करने के लिए उल्टे विधि का उपयोग करते समय अनुकूलन के लिए कई चरण हैं। सबसे पहले, 3 डी प्रिंटिंग विधि का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जो उच्च रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं का उत्पादन करता है। असमान साइड की दीवारें सूक्ष्मनलिकाएं पकड़ने का कारण बन सकती हैं, जो प्रवाह को बाधित करेगी। कुओं को बहुत गहरा नहीं होना चाहिए (इस अध्ययन में 2 मिमी मोटी तेल परत के साथ 150-200 किमी गहरे कुओं का उपयोग किया गया था)। प्रयोगकर्ताओं को सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त करने के लिए परीक्षण और त्रुटि द्वारा इन मापदंडों को थोड़ा समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
प्रवाह सेल विधि और उल्टे विधि का उपयोग विभिन्न लेखकों द्वारा विभिन्न प्रकार के प्रभावों को देखने के लिए किया गया है जो सक्रिय प्रवाह को प्रभावित करते हैं, जिसमें विभिन्न तेल12 और पनडुब्बी संरचनाएं13 शामिल हैं। विधि का चुनाव प्रयोगात्मक उद्देश्य पर निर्भर करता है। प्रवाह सेल विधि का उपयोग करते हुए, सक्रिय परत के ऊपर से ऑप्टिकल इमेजिंग अलग-अलग तरल पदार्थों के कारण उल्टे विधि की तुलना में स्पष्ट है। फ्लो सेल विधि में, इमेजिंग एक ग्लास कवर स्लिप और पानी की एक पतली परत के माध्यम से की जाती है, जबकि उल्टे विधि को शीर्ष पर तेल की परत रखने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इसका मतलब है कि उल्टे विधि के लिए एक लंबी कार्य दूरी के उद्देश्य की आवश्यकता होती है, और छवि की गुणवत्ता कम हो जाती है। छवि गुणवत्ता अंतर क्रमशः चित्रा 2 डी (प्रवाह सेल विधि) और चित्रा 3 (उल्टे विधि), और मूवी 1 और मूवी 2 की तुलना करके देखा जा सकता है। चित्र 2 की तुलना में चित्र 3 के लिए लंबी कार्य दूरी के साथ कम आवर्धन लेंस की आवश्यकता थी। उल्टे विधि के लिए इन इमेजिंग नुकसान से बचा जा सकता है यदि एक उपयुक्त उलटा माइक्रोस्कोप उपलब्ध है, माइक्रोस्कोप स्लाइड सब्सट्रेट्स के लिए उपयुक्त कार्य दूरी के साथ उद्देश्यों के साथ संयुक्त है। पतले ग्लास का उपयोग मानक कामकाजी दूरी उद्देश्यों के उपयोग की अनुमति देने के लिए सब्सट्रेट के रूप में किया जा सकता है।
एक लाभ के रूप में, उल्टे ज्यामिति तेल चिपचिपाहट की एक विस्तृत श्रृंखला के उपयोग की अनुमति देती है, जरूरी नहीं कि झूलने वाली बाल्टी सेंट्रीफ्यूजेशन की आवश्यकता हो (यदि यह उपलब्ध नहीं है), और मोल्ड तैयार होने के बाद सिस्टम की तैयारी अपेक्षाकृत आसान है। हालांकि, उल्टे विधि का उपयोग करके कुओं में कारावास के लिए, सामग्री को अच्छी तरह से परिभाषित 2 डी परत में लाने के लिए कुछ सेंट्रीफ्यूजेशन महत्वपूर्ण हो सकते हैं।
प्रवाह सेल विधि का उपयोग हाल ही में प्रयोगों में बहुत सफलतापूर्वक किया गया है जहां एक निरंतर सक्रिय परत की आवश्यकता होती है। हमारे हाल के काम ने सक्रिय परत में टोपोलॉजिकल दोषों की गतिशीलता को देखा है, जहां उच्च गुणवत्ता इमेजिंग और बनावटविश्लेषण महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, प्रवाह सेल विधि का उपयोग सक्रिय प्रवाह16 और स्तंभों पर तेल-पनडुब्बी माइक्रोस्ट्रक्चर के प्रभावों की जांच करने के लिए किया गया है ताकि सक्रिय प्रवाह31 में दोषों को फंसाया जा सके। यह विधि एक निरंतर सक्रिय परत के गठन के लिए बहुत अच्छी तरह से काम करती है, और छवि की गुणवत्ता उत्कृष्ट है। हालांकि, अंतिम 2 डी सक्रिय परत का उत्पादन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सेंट्रीफ्यूजेशन चरण को पूरा करना मुश्किल हो सकता है, और प्रवाह कोशिकाओं को लीक और हवा के बुलबुले का खतरा होता है। उल्टे विधि उच्च सफलता दर के साथ एक बहुत ही उपयोगी विकल्प है, निर्माण में आसान है, और किसी भी सब्सट्रेट पैटर्न या ज्यामिति के लिए उपयोग किया जा सकता है बशर्ते एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी मुद्रित मास्टर मोल्ड बनाया जा सके। यह विधि सक्रिय नेमेटिक गतिशीलता पर ज्यामितीय कारावास के प्रभावों को देखने के लिए भी उपयोगी है क्योंकि यह कुओं को भरने को अपेक्षाकृत सरल बनाता है।
इस पेपर में, सूक्ष्मनलिकाएं और किन्सिन मोटर्स से एक सक्रिय नेमेटिक बनाने के दो तरीकों का वर्णन किया गया है, साथ ही कुओं में सामग्री को सीमित करने की एक तकनीक भी है। प्रस्तुत प्रणाली वर्तमान में साहित्य में एक सक्रिय नेमैटिक चरण का सबसे साफ उदाहरण का प्रतिनिधित्व करती है और दुनिया भर के कई समूहों द्वारा पुन: प्रस्तुत की गई है। इस सामग्री का महत्व न केवल इसके घटकों की जैविक उत्पत्ति में निहित है, बल्कि इसलिए भी कि यह सक्रिय आदेशित तरल पदार्थों में एक पूरी तरह से नई दिशा खोलता है। इस प्रणाली के साथ काम करके और इसके मौलिक गुणों को स्पष्ट करके, वैज्ञानिक पूरी तरह से सिंथेटिक सक्रिय चरणों के डिजाइन की ओर बढ़ सकते हैं।
सक्रिय नेमैटिक्स पर कारावास के प्रभावों पर केंद्रित प्रयोगों में टोपोलॉजिकल कारावास के तहत सक्रिय प्रवाह और टोपोलॉजिकल दोष गतिशीलता के व्यवहार के बारे में मौलिक सवालों के जवाब देने की क्षमता है। यहां प्रस्तुत विधि विभिन्न प्रकार के ज्यामिति-केंद्रित प्रयोगों और उनके विश्लेषण के प्रदर्शन में सहायता करेगी, जिसमें माइक्रोफ्लुइडिक्स और सक्रिय मिश्रण शामिल हैं।
The authors have nothing to disclose.
लेखक उदार वित्त पोषण के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफ) पुरस्कार डीएमआर -1808926 को स्वीकार करना चाहते हैं। इस परियोजना को एनएसएफ द्वारा विज्ञान और प्रौद्योगिकी में अनुसंधान उत्कृष्टता केंद्र के माध्यम से भी समर्थित किया गया था: कैलिफोर्निया मर्सेड विश्वविद्यालय में सेलुलर और बायोमोलेक्यूलर मशीनों के लिए केंद्र (एचआरडी -1547848) और ब्रांडिस बायोमैटेरियल्स सुविधा सामग्री अनुसंधान विज्ञान और इंजीनियरिंग केंद्र (डीएमआर -2011486)। हम मोल्ड को 3 डी प्रिंटिंग में सहायता के लिए कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय में डॉ बिन लियू को धन्यवाद देना चाहते हैं, और उल्टे प्रयोगात्मक विधि के विकास के दौरान वैज्ञानिक सलाह के लिए डॉ जोर्डी इग्नेस।
20 kD PEG (polyethylene glycol)) | Sigma Aldrich | 1419109 | Depletion agent CAS Number: 125061-88-3 |
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | M6514-50ML | CAS Number: 2530-85-0 |
3D printer & Resin | Phrozen | Phrozen sonic mini 8K 3D printer – Aqua Gray 8K resin | |
40% Acrylamide Solution | BIO-RAD | 1610140 | CAS Number: 7732-18-5, 79-06-1 |
Acetic Acid | Fisher | CAS Number: 64-19-7 | |
Acetone | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-64-1 | |
Adhesive sheets (NOTE: "Parafilm" is an alternative) | Grace Bio-Labs | 620001 | SecureSeal |
Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | CAS Number: 7727-54-0 |
Aquapel (NOTE: "RainX" is an alternative) | Aquapel Glass Treatment | hydrophobic glass treatment | |
ATP (Adenosine triphosphate) | Sigma Aldrich | A1852 | CAS Number: 34369-07-8 |
Beakers | VWR | ||
Catalase | Sigma Aldrich | C9322 | CAS Number: "9001-05-2" |
Desiccator | Bel-art | ||
Digital CMOS camera | Hamamatsu | ORCA – Flash4.0 LT+ | |
DTT (Dithiothreitol) | Sigma Aldrich | D9779 | CAS Number: "3483-12-3" |
EGTA (3,12-bis(carboxymethyl)-6,9-dioxa-3,12-diazatetradecane-1,14-dioic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00004291 | CAS Number: 67-42-5 |
Ethanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 64-17-5 | |
Fluorescence microscope | Leica | DM 2500P | |
Glass Coverslips | VWR | 48368-040 | |
Glass Slides | VWR | 16004-430 | |
Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | CAS Number: 50-99-7 |
Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | 345386 | CAS Number: 9001-37-0 |
GMPCPP (guanylyl 5'-α,β-methylenediphosphonate) | Jena Bioscience | NU-405S | CAS Number: 14997-54-7 |
HFE7500 Oil | 3M | ||
Hot Plate | Fisher Scientific | Thermix hot plate model 100M | |
Isopropyl Alcohol | VWR | ||
KCl (potassium chloride) | Sigma Aldrich | P5405 | CAS Number: 7447-40-7 |
Methanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-56-1 | |
MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma Aldrich | 208337 | CAS Number: 7786-30-3 |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf – Thermo Fisher | 1.5 mL | |
Nanopure water purifier | Sartorius | arium mini | |
NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma Aldrich | SX0603 | CAS Number: 1310-73-2 |
Petri Dishes | VWR | ||
PH Meter | Thermo Scientist | Orion 3 STAR | |
Phosphoenol-pyruvate (PEP) | Sigma Aldrich | MFCD00044476 | CAS Number: 4265-07-0 |
PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid) | Sigma Aldrich | CAS Number: 5625-37-6 | |
Pipettes (0.2 – 1000 µl) | VWR | ||
Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 2594628 | |
RAN Surfactant (NOTE: "FluoSurf" from Emulso is an alternative) | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
Silicon Oil (100mpa s-1000 mpa s) | Sigma Aldrich | CAS Number: 63148-52-7 | |
Streptavidin | Thermofisher | S888 | |
Swinging Bucket Centrifuge | Thermo Scientist | Sorvall legend RT+ | |
Sylgard 184 Elastomer base | World Precision Instruments | SYLG184 | |
Sylgard 184 Elastomer Curing agent | World Precision Instruments | SYLG184 | |
Table top centrifuge | Eppendorf | MiniSpin Plus | |
TEMED (Tetramethylethylenediamine) | BIO-RAD | 1610800 | CAS Number: 110-18-9 |
Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00006846 | CAS Number: 53188-07-1 |
Tubulin | Cytoskeleton | T240-B | |
Tubulin (Rhodamine labeled) | Cytoskeleton | TL590M-A | |
Ultracentrifuge | Beckman | Optima Max-TL | |
UV Light | RapidFix | ||
UV-curable glue (NOTE: "Norland NO81" is an alternative) | RapidFix | ||
Water Bath | Thelco | ||
Whatman Filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001325 |