Construcción de péptidos cíclicos penetrantes de células para mejorar la penetración de barreras biológicas
Summary
Este protocolo describe la síntesis de péptidos cíclicos penetrantes de células con enlaces cruzados aromáticos y la evaluación de su permeabilidad a través de barreras biológicas.
Abstract
El cáncer ha sido un gran desafío en la salud mundial. Sin embargo, el complejo microambiente tumoral generalmente limita el acceso de la terapéutica a las células tumorales más profundas, lo que lleva a la recurrencia del tumor. Para conquistar la penetración limitada de las barreras biológicas, se han descubierto péptidos de penetración celular (CPP) con excelente capacidad de translocación de membrana y han surgido como transportadores moleculares útiles para entregar diversas cargas a las células. Sin embargo, las CPP lineales convencionales generalmente muestran una estabilidad proteolítica comprometida, lo que limita su permeabilidad a través de las barreras biológicas. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos transportadores moleculares que puedan penetrar las barreras biológicas y exhibir una mayor estabilidad proteolítica es muy deseado para promover la eficiencia de la administración de fármacos en aplicaciones biomédicas. Hemos sintetizado previamente un panel de CPP cíclicos cortos con enlaces cruzados aromáticos, que exhibieron una permeabilidad superior en células y tejidos cancerosos en comparación con sus contrapartes lineales. Aquí, se describe un protocolo conciso para la síntesis del péptido cíclico de poliarginina R8 marcado con fluorescencia y su contraparte lineal, así como los pasos clave para investigar su permeabilidad celular.
Introduction
Las últimas décadas han sido testigos de rápidos avances en el desarrollo de péptidos de penetración celular (CPP) para la administración de fármacos. Los CPP se han utilizado ampliamente como transportadores moleculares para el tratamiento de una variedad de enfermedades potencialmente mortales, incluidos los trastornos neurológicos1,2, las enfermedades cardíacas3, la diabetes4, la dermatosis5 y el cáncer 6,7. El cáncer sigue siendo una carga sanitaria mundial acompañada de una alta tasa de morbilidad y mortalidad a pesar de los esfuerzos de investigación generalizados8. Un obstáculo serio para el tratamiento del cáncer es el acceso limitado de la terapéutica a las células tumorales más profundas debido a barreras fisiológicas como la matriz extracelular compacta (MEC), la vasculatura tumoral anormal, las barreras de membrana múltiple y la alta presión del líquido intersticial (IFP)9. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos CPP con capacidad superior para entregar cargas a través de barreras biológicas se considera una estrategia esencial para el tratamiento del cáncer10,11.
Las CPP pueden clasificarse en CPP catiónicas, anfipáticas e hidrofóbicas en términos de sus propiedades fisicoquímicas12. Entre estos, el péptido VIH-TAT cargado positivamente y la poliarginina sintética son de considerable importancia en la investigación biomédica y han sido ampliamente estudiados para facilitar la administración intracelularde fármacos 13. Tunnemann et al. informaron que una longitud mínima de ocho argininas es esencial para la penetración celular eficiente de los péptidos sintéticos de poliarginina, basado en un estudio de permeabilidad celular realizado con péptidos R3 a R1214. Sin embargo, estos CPP generalmente tienen vidas medias plasmáticas cortas debido a su rápida hidrólisis in vivo. Además, se sabe poco sobre la optimización de la estructura química de los CPP para aumentar su capacidad de transbarrera, ya que es difícil penetrar múltiples membranas celulares15. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos transportadores moleculares capaces de penetrar las barreras biológicas es muy deseado para mejorar la eficiencia de la administración de fármacos. En 2020, Komin et al.16 descubrieron un CPP llamado péptido CL, que contiene un motivo de hélice (RLLRLLR) y una cola de poliarginina (R7) para cruzar la monocapa epitelial. También se sintetizó un conjunto de variantes peptídicas CL alterando el patrón helicoidal. Esta exploración podría ser una guía importante para el desarrollo de nuevos CPP para la entrega de cargas a través de barreras biológicas. Además, Dietrich et al. optimizaron la permeabilidad celular del péptido StAX, inhibiendo la vía de señalización Wnt/β-catenina al aumentar la hidrofobicidad global de los péptidos17.
La restricción conformacional de péptidos lineales no estructurados por ciclación es una forma efectiva de mejorar su estabilidad proteolítica y permeabilidad18,19,20. El refuerzo estructural aumenta la resistencia a la proteasa de los péptidos cíclicos, haciéndolos más estables in vivo en comparación con sus contrapartes lineales. Además, la ciclación de péptidos puede potencialmente enmascarar la columna vertebral del péptido polar al promover el enlace de hidrógeno intramolecular, aumentando así la permeabilidad de la membrana de los péptidos21. En las últimas dos décadas, los métodos de ciclación quimioselectiva se han convertido en estrategias efectivas para la construcción de péptidos cíclicos con diferentes arquitecturas, como todo hidrocarburo, lactámico, triazol, m-xileno, perfluoroarilo y otros enlaces cruzados22,23. La barrera biológica impuesta por el sofisticado microambiente tumoral podría reducir la penetración de fármacos en tumores sólidos24. Hemos encontrado previamente que los CPP cíclicos mostraron una resistencia superior a la digestión enzimática sobre sus contrapartes lineales20. Además, la hidrofobicidad global de los péptidos es crítica para su mayor permeabilidad celular22. Sobre la base de los estudios discutidos anteriormente, se puede plantear la hipótesis de que la combinación de un patrón cargado positivamente, hidrofobicidad general elevada y estabilidad de proteólisis mejorada aumenta la permeabilidad de las CPP a través de las barreras biológicas. En un estudio reciente, identificamos dos CPP cíclicos con enlaces cruzados aromáticos en las posiciones i e i + 7 que exhiben una mejor permeabilidad en células y tejidos tumorales en comparación con sus contrapartes lineales15. Aquí, se presenta un protocolo sintético conciso para la síntesis de CPP cíclicos marcados con fluorescencia y los pasos clave para investigar su permeabilidad.
Protocol
Representative Results
Discussion
La estabilización química de péptidos mediante la incorporación de restricciones conformacionales ha demostrado ser una estrategia eficaz para mejorar la estabilidad y permeabilidad celular del péptido26. En este protocolo, se describe un procedimiento paso a paso para la síntesis de CPP cíclicos con enlaces cruzados aromáticos y la evaluación de su permeabilidad a través de barreras biológicas. En comparación con los enlaces cruzados hidrofílicos lactámicos o triazoles<sup class="xr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo cuenta con el apoyo de la Fundación de Ciencias Naturales de China (21708031), la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (BX20180264, 2018M643519) y los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (2682021ZTPY075).
Materials
| 1,2-ethanedithiol | Aladdin | K1722093 | stench |
| 2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | HEOWNS | A-0443697 | |
| 4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl | TCI | B1921 | |
| 4T1 cells | ATCC | 4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
| Acetonitrile | Adamas | 1484971 | toxicity |
| Dichloromethane | Energy | W330229 | skin harmful |
| Diethyl ether | Aldrich | 673811 | flammable |
| Dimethyl sulfoxide | Beyotime | ST038 | skin harmful |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | ||
| Electrospray Ionization Mass Spectrometer | Waters | G2-S Tof | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | BioFroxx | 1340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | ||
| Flow cytometer | Beckman Coulter | CytoFLEX | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC) | Energy | E0801812500 | |
| Fluorescent microscope | Carl Zeiss | Axio Observer 7 | |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | HEOWNS | F-81070 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | GL Biochem | GLS201115-35202 | |
| Fmoc-βAla-OH | Adamas | 51341C | |
| HeLa cells | ATCC | HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
| High-Performance Liquid Chromatography | Agilent | Agilent 1260 | |
| High-Performance Liquid Chromatography column | Agilent | Poroshell EC-C18 120, 4.6 × 150 mm (pore size 120 Å, particle size 4 μm) | |
| Lyophilizer | SP Scientific | Vir Tis | |
| Methanol | Aldrich | 9758 | toxicity |
| Microtiter plate | Thermo μdrop plate | N12391 | |
| Morpholine | HEOWNS | M99040 | irritant |
| Multi-technology microplate reader | Thermo | VARIOSKAN LUX | |
| N,N-Diisopropylethylamine | HEOWNS | E-81416 | irritant |
| N,N-Dimethyl formamide | Energy | B020051 | harmful to skin |
| Poly-Prep column | Bio-Rad | 7321010 | polypropylene chromatography columns |
| Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g) | GL Biochem | GLS180301-49101 | |
| Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
| Tissue culture plate insert | LABSELECT | 14211 | |
| Trifluoroacetic acid | HEOWNS | T63278 | corrosive |
| Triisopropylsilane | HEOWNS | T-0284475 | |
| Trypsin | BioFroxx | 1004 | |
| Vacuum manifold | Promega | A7231 |
Referências
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