Den nuværende protokol beskriver en optimeret metode til histologisk observation af galler induceret af Plasmodiophora brassicae. Vibrerende sektioner af hypocotyler ryddes før fluorescensbilleddannelse for at studere involvering af transkriptionsfaktorer og phytohormoner under sygdomsprogression. Denne protokol overvinder begrænsninger for harpiksindlejring, hvilket muliggør plantavisualisering af fluorescerende proteiner.
Infektion af Brassica-afgrøder af den jordbårne protist Plasmodiophora brassicae fører til galdedannelse på de underjordiske organer. Dannelsen af galler kræver cellulær omprogrammering og ændringer i metabolismen af den inficerede plante. Dette er nødvendigt for at etablere en patogenorienteret fysiologisk vask, som værtsnæringsstofferne omdirigeres mod. For en fuldstændig forståelse af denne særlige plantepatogeninteraktion og de mekanismer, hvormed værtsvækst og udvikling undergraves og repatternes, er det vigtigt at spore og observere de interne ændringer, der ledsager galdedannelse med cellulær opløsning. Metoder, der kombinerer fluorescerende pletter og fluorescerende proteiner, anvendes ofte til at studere anatomiske og fysiologiske reaktioner i planter. Desværre fungerer den store størrelse af galler og deres lave gennemsigtighed som store forhindringer for at udføre helmonteringsobservationer under mikroskopet. Desuden begrænser lav gennemsigtighed anvendelsen af fluorescensmikroskopi til at studere udvikling af clubroot sygdom og galdedannelse. Denne artikel præsenterer en optimeret metode til fastgørelse og rydning af galler for at lette epifluorescens og konfokal mikroskopi til inspektion af P. brassicae-inficerede galler. En vævsrydningsprotokol til hurtig optisk clearing blev brugt efterfulgt af vibratomsektionering til at detektere anatomiske ændringer og lokalisere genekspression med promotorfusioner og reporterlinjer mærket med fluorescerende proteiner. Denne metode vil vise sig nyttig til at studere cellulære og fysiologiske reaktioner i andre patogenudløste strukturer i planter, såsom nematodeinduceret syncytia og rodknuder samt bladgaller og deformationer forårsaget af insekter.
Planter, der er påvirket af patogener eller insekter, kan udvikle unormale strukturer (organdeformationer eller galler), som gør det muligt for angriberen at indtage næringsstoffer og reproducere1. Her blev der foretaget en effektiv histopatologisk tilgang til at studere de ændringer, der finder sted i galler, der udvikler sig på de underjordiske dele af planter inficeret med protisten Plasmodiophora brassicae (figur 1). Den mindre tråd forbundet med dette patogen fremgår af det faktum, at P. brassicae hvilesporer kan bevare deres evne til at invadere planter i mange år. I tilfælde af storstilet dyrkning af raps (Brassica napus) er dette et alvorligt problem, da økonomiske faktorer begrænser sædskiftet, hvilket fører til hvilende sporeophobning i jorden2. Rapsens resistens over for clubroot sygdom forårsaget af P. brassicae er genetisk bestemt. Desværre overgår patogenet ofte resistens på grund af dets biologi og den smalle genetiske pool, hvorfra raps stammer. Derfor er det blevet relevant at studere reaktionerne efter infektion i værtsplanter og deres evne til at bremse sygdomsprogression eller forhindre visse symptomer i at udvikle sig.
I clubroot sygdom vurderes sværhedsgraden generelt baseret på udviklingen af galler og graden af rodsystemskader. Dette er kendt som sygdomsindekset-DI3. Det fanger dog ikke fuldt ud den sande vurdering af denne plante-patogen-interaktion. Det omhandler især ikke, hvordan patogenet fordeles i rødderne, og om planten kan begrænse P. brassicae bevægelse inden for dets væv. Desuden er det ikke let at forudse i hvilket omfang P. brassicae omprogrammerer underjordisk orgelanatomi. Undersøgelser af modelanlægget Arabidopsis thaliana har vist, at P. brassicae Infektion fører til hæmning af xylogenese (både initierings- og modningstrin) og forbedring af phloemdifferentiering inden for galler4,5. Desuden afslutter cambialcelleafkom i rødder og hypocotyler af inficerede planter ikke den mitotiske tilstand og spredes længere end i sunde planter.6. Denne proces styrer galdens endelige størrelse og bestemmer antallet af patogen hvilende sporer produceret i den inficerede plante. P. brassicae-drevet udviklingsmæssig, metabolisk og fysiologisk omprogrammering i værten er meget kompleks7; Derfor er anvendelsen af værktøjer, der muliggør inspektion af interne ændringer inden for galler, afgørende for korrekt vurdering af denne interaktion. Livscyklusudviklingen af P. brassicae ledsages af omprogrammering af værtscellemetabolismen, som kan observeres som stivelse eller lipidaflejring7,8. Den største hindring for den vellykkede mikroskopi af galler kommer fra deres lave gennemsigtighed. På grund af dette stammer størstedelen af histologiske prøver, der præsenterer klubrodsdrevne ændringer inden for galler, fra fikseringsindlejringsteknikker (voks eller harpiks) efterfulgt af mikrotomsektionering. Sådanne tilgange blev med succes brugt til at lokalisere promotoraktiviteten for adskillige gener, der er aktive i clubroot galls4,5 eller forskellige farvningsteknikker, der letter observationen af P. brassicae udvikling i livscyklussen9. Det skal dog bemærkes, at fikserings- og indlejringsstadierne er tidskrævende og resulterer i delvis eller fuldstændig udvaskning af vigtige biomolekyler (f.eks. lipider), hvilket i væsentlig grad hindrer visse observationer. Nylig P. brassicae livscyklusprogression i værten blev visualiseret ved hjælp af fluorescerende In Situ Hybridization (FISH), hvor en SABATH-type methyltransferase (PbBSMT) genspecifik sonde blev brugt til at markere hvilende sporedannelse10. Et godt alternativ er brugen af andre fluorescensbaserede metoder, hvor autofluorescensen af nogle cellulære komponenter, aktiviteten af 5′- opstrøms regulerende regioner af gener smeltet sammen med fluorescerende proteinmarkører og akkumulering af bestemte fluorescerende mærkede proteiner kan ses. Ud over den lave gennemsigtighed af prøverne arbejder en stor ulempe forbundet med sådanne objekter imidlertid med ikke-fastgjorte prøver, hvilket signifikant reducerer den tid, hvor billeder af god kvalitet kan dokumenteres. I 2015 blev Kurihara et al.11 udviklet et rydningsreagens, som gør det muligt at bevare fluorescerende proteiner og øger gennemsigtigheden af plantevævsprøver. Derudover er den kompatibel med adskillige histologiske pletter. For nylig blev den samme teknik med succes anvendt til at visualisere forskellige cellevægskomponenter i plantevæv12,13. Her er denne protokol blevet brugt til at analysere forskellige aspekter af udviklingen af clubroot galde. Arbejdsgangen begynder med fiksering af galler, vibratomsektionering, vævsrensning, farvning og fluorescensbilleddannelse. Afhængigt af ens behov, direkte eller efter særlig farvning, kan de resulterende sektioner underkastes inspektion under et epifluorescens eller konfokalmikroskop. Denne metode giver en effektiv løsning til at studere lokale ændringer i genekspression og fysiologiske reaktioner, herunder phytohormonbalance og signalering. Sygdomsprogression kan spores ved at se på fordelingsmønsteret for hvilesporer og modningsdynamik. Desuden kan protokollen let anvendes til billeddannelseskarakteristiske ændringer inden for P. brassicae inficerede planter, herunder hæmning af xylogenese eller værtsplanteforsvarsresponser, der er synlige som lokal lignificering i resistente genotyper. Eksempler i denne protokol kommer fra billeddannelse udført på Arabidopsis thaliana model; Protokollen kan dog også anvendes på andre afgrødearter, der tilhører Brassicaceae Familie. Metoden beskrevet nedenfor vil lette fremtidige detaljerede undersøgelser af cellulære strukturer og molekylære ændringer, der ledsager galdedannelse i P. brassicae-inficerede planter.
Protokollens generelle arbejdsgang er ret ligetil, og alle stadier af galdeudvikling kan let afbildes og karakteriseres (figur 2). Da P. brassicae er et jordbåren patogen, skal alle eksperimenter udføres i jordbaserede systemer. Patogenet foretrækker sure forhold; Derfor skal der anvendes ikke-kalkbehandlede jordsubstrater. Selvom P. brassicae ikke udgør en trussel mod mennesker, er det strengt et plantepatogen, der kan spredes gennem jord og vand. Derfor skal alle dele af den inficerede plante såvel som jorden ødelægges efter eksperimentet ved autoklavering eller ved behandling med blegemiddel.
Anvendelse af rydningsopløsningen på vibratomskårne sektioner af galler forbedrer helt sikkert evnen til at studere den biotrofiske interaktion mellem P. brassicae og værtsplanten. Selvom clearingprotokollen gælder selv for håndsektioner, fungerer den bedre med vibratomsektioner. Fastgørelse af prøver i PFA-fikseringsmiddel fungerer som et kritisk trin i protokollen, da prøver derefter kan opbevares ved 4 °C i et par dage, før de fortsætter med sektionering. Dette giver fleksibilitet til at opbevare prøver i en begrænset periode uden at gå på kompromis med ekspressionen og konserveringen af fluorescerende proteiner under fiksering.
Nile Red (i DMSO eller methanol) er uforenelig med harpikssektioner på grund af dets hydrofobicitet, som opløser harpiks og ødelægger harpiksindlejrede sektioner17. Således viser vibratomsektioner sig at være medvirkende til at studere patogenfordelingen og dens livscyklus inden for udvikling af galler, hvor Nilrød farvning let kan bruges.
Rydningsopløsningen, der anvendes i denne protokol, er meget alsidig12, hvilket gør det muligt at anvende en række fluorescenspletter i forskellige kombinationer til at plette forskellige biomolekyler / komponenter i cellevæggene (suberin, lignin, cellulose og chitin i svampeinteraktioner). Det er også muligt at modfarve sektioner af fluorescerende GFP-markørlinjer og derved korrelere promotoraktiviteten eller proteinakkumuleringsmønsteret med tilstedeværelsen af patogenet i bestemte celler eller områder af galden. Imidlertid kunne baggrundsautofluorescens fra xylem og patogenfyldte kæmpeceller ikke elimineres, selv efter clearingprotokollen. Dette udgør en begrænsning for at se på fluorescerende markører i de senere stadier af galdedannelse, især når man bruger et epifluorescensmikroskop og billeddannelse af svage signaler.
På grund af de lave niveauer af ekspression/akkumulering af fluorescerende signaler er transkriptionsfaktorer vanskelige at opdage, men med denne teknik er det muligt at opnå tilfredsstillende billeder for dem. Samlet set udvider kombinationen af vibratomsektionering med vævsrensningsmetoden værktøjskassen til histologiske observationer af komplekse galdevæv. Fleksibiliteten i denne protokol letter processen med vævsfiksering og reducerer den tid, der kræves til skæring og billeddannelse af friske vævsprøver for at observere fluorescerende proteiner og promotoraktiviteter. Med yderligere forbedringer og ved at udnytte andre fluorescerende farvestoffer, der er specifikke for forskellige biomolekyler, vil denne metode markere større fremskridt inden for histologiske undersøgelser og billedanalyse af tæt, uigennemsigtigt væv med kompleks vævsorganisation. I nyere tid har den præsenterede vævsrensningsmetode vist sig som en populær og udbredt protokol til at kombinere og muliggøre samtidig erhvervelse af forskellige fluorescerende signaler11,12,13. Fremtidig udvikling og modifikationer i sådanne teknikker vil i høj grad forbedre billedopløsningen til observation af plantepatogeninteraktioner på celleniveau.
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet blev støttet af National Science Centre Poland OPUS17 bevilling nr. 2019/33/B/NZ9/00751 “Long distance Vascular Coordination in Plants Infected by Plasmodiophora brassicae“. Vi takker prof. Yrjö Helariutta (Sainsbury Laboratory, University of Cambridge) for at dele proHCA2::erRFP-linjen .
2N Sulfuric acid (H2SO4) | Roth | UN2796 | pH adjustment |
Agarose | PRONA | BGQT100 | Embedding |
Basic Fuchsin | BIOSHOP | BSF410.5 | Fluorescent dye |
Calcofluor White | Sigma Aldrich | 18909-100ML-F | Fluorescent dye |
Commercial Bleach | Domestos | ||
Cyanoacrylate/ Instant glue | Kropelka | Adhesive | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | BIOSHOP | DMS555.500 | Solvent |
Epifluorescence microscope | Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system | Carl Zeiss M2 | Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used |
Fully automated Vibratome | Leica | VT1200 S | |
Lightmeter /Photometer | LI-COR Biosciences | LI-250A + LI-190R quantum sensor | For measuring light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband |
Masking tape | For sticking agarose block on mould | ||
Murashige & Skoog Medium (MS Medium) | Duchefa Biochemie | MO222.0050 | Plant Growth Medium |
Nile Red | Sigma Aldrich | N3013-100MG | Fluorescent dye |
Paraformaldehyde PFA | Sigma Aldrich | 158127-100G | Fixative |
Potassium Chloride (KCl) | POCH | 739740114 | PBS component |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | P1767-250G | pH adjustment |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | BIOSHOP | PPM302.500 | PBS component |
Sodium chloride (NaCl) | BIOSHOP | SOD001.1 | PBS component |
Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-25G | Clearing Solution |
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4 · 2H2O) | POCH | 799490116 | PBS component |
Triton X-100 | BIOSHOP | TRX506.100 | Fixative |
Urea | Sigma Aldrich | U5378-100G | Clearing Solution |
Vacuum/Pressure pump and Dessicator | Welch by Gardner Denver | 2522C-02 | For Vacuum Infilteration |
Xylitol | Sigma Aldrich | X3375-25G | Clearing Solution (componenet) |