该方法使用96孔板形式量化微生物丰度,以板菌落形成单位(CFU),并应用于整个果蝇匀浆样品中的 果蝇 微生物组。CFU使用此处提供的自动图像分析软件进行计数。
动物的肠道被共生微生物定植,这些微生物会影响宿主的发育、健康和行为。定植的精确定量对于研究宿主和微生物之间的复杂相互作用至关重要,既可以验证微生物组成,又可以研究其影响。 黑腹果蝇具有低天然微生物多样性,并且以确定的微生物组成进行饲养是经济的,已成为研究肠道微生物组的模式生物。分析单个生物体的微生物组需要确定存在哪些微生物物种并量化其绝对丰度。本文提出了一种分析大量个体苍蝇微生物组的方法。果蝇在96孔板中制备,可以一次处理大量样品。通过将多达96个全果蝇匀浆接种在单个琼脂平板上的一系列斑点上,然后计数在每个点中生长的菌落形成单位(CFU)来量化微生物丰度。该电镀系统与自动 CFU 定量平台配对,该平台结合了板的摄影、荧光菌落的分化以及使用 ImageJ 插件的菌落自动计数。优点是(i)该方法足够灵敏,可以检测处理之间的差异,(ii)点镀方法与传统电镀方法一样准确,以及(iii)自动计数过程准确且比手动计数更快。此处介绍的工作流程能够在大量重复中对CFU进行高通量定量,并可应用于其他微生物学研究系统,包括 体外 和其他小动物模型。
肠道微生物群与其动物宿主之间的关系越来越处于生物学研究1的最前沿,这表明微生物组的菌株组成对宿主生理学很重要2,3,4。发现的速度受到混杂因素的限制,例如高自然个体间变异和定植细菌的高度多样性5,6,7。果蝇黑腹果蝇因其天然的低多样性微生物组、易于处理和强大的宿主遗传学而成为一种有前途的模型8,9,10,11。苍蝇可以无菌并与定义的微生物群12重新关联,并且已经表明菌群影响苍蝇的生理性状13,14。先天菌群由一组有限的细菌组成,这些细菌都是可培养的,这些细菌的近亲也是哺乳动物肠道的内源性,包括乳酸杆菌、变形杆菌和肠球菌15。
研究微生物组对宿主性状的影响需要根据存在哪些物种及其绝对丰度来量化微生物组16。分析果蝇微生物组的主要方法是菌落形成单位(CFU)计数17,16S rRNA基因扩增子测序9和16S rRNA基因18的qPCR。无需昂贵的试剂即可获得CFU计数,并且它们确认了细菌细胞的活力19。包括qPCR在内的16S技术具有优势,可以在不考虑其生长要求或菌落形态的情况下确定微生物的分类特性20。
在实验使用具有已知细菌(gnotobiotic 苍蝇)定义微生物组的苍蝇的情况下,CFU 计数比测序具有特别的优势21。测序成本高昂,需要DNA提取、基于PCR的文库制备和高通量测序才能获得相对丰度22。由于成本高,通常需要批量执行高通量测序方法,以降低每个样品的价格23。需要进一步的方法,如qPCR以获得绝对丰度16。相比之下,CFU计数快速且便宜,并提供活细胞的绝对数量。果蝇8和其他小微生物组模型24,包括蠕虫秀丽隐杆线虫25,26和幼虫斑马鱼Danio rerio,以GNTOBIO方式生长27,具有有限范围的细菌,它们具有已知的生长特征28。在这些情况下,特别是对于侏儒生物,CFU计数可以区分多物种肠道群落中的所有细菌种类21,27,29。更高通量的CFU计数方法将进一步提高测量微生物组组成的成本效益和速度,并可应用于许多其他微生物学实验。
通过在琼脂基生长培养基上连续稀释细菌悬浮液来计数CFU是整个微生物学领域的标准方法。然后手动计数在平板上生长的菌落。稀释液允许研究人员选择可计数的菌落密度(例如,每个板~100 CFU),这意味着菌落不会相互生长并且可以在合理的时间内计数。大多数微生物学家使用与140年前在Robert Koch实验室开发的CFU计数方法基本相同的方法,对于许多应用,这种方法仍然足够。但是,当寻求量化大量样品时会出现问题。单个样品可能需要对样品进行 1 到 10 次连续稀释才能获得可计数的 CFU,因此涉及几十个样品的实验变得繁重。已经开发了各种方法来提高CFU枚举的效率。自动螺旋镀消除了对连续稀释30的需要,使得CFU计数只需要一个板,但增加了样品铺板的时间。单板连续稀释点样 (SP-SDS) 允许从每个样品31 的更少板中估算 CFU。这些方法是对传统铺层方法的改进,但仍需要单独处理和接种细菌样品,因此对于高通量来说并不理想。在96孔板中处理样品并在矩形琼脂平板上点镀这96个样品可大大提高样品的通量19。
微生物组通常由多种菌株和物种组成。虽然物种通常可以通过菌落形态或生长培养基来区分,但荧光可用于进一步区分不同类型的细菌及其生长性状32。例如,同一物种的不同基因型可以用不同的基因编码荧光蛋白标记。结合荧光的平板成像方法使研究人员能够在基于CFU的测定中利用这些遗传技术32。将荧光纳入高通量CFU计数方法将进一步提高其实用性。
当有大量样品时,手动计数CFU变得很麻烦。CFU的自动计数可以通过拍摄板并使用专用软件处理图像来进行33。Sieuwerts等人使用传统的数码摄影和ImageJ软件19将点镀的提高的接种效率与自动菌落计数相结合。
筛选特定微生物表型和宿主关联的高通量方法将有助于研究微生物群落组装及其对宿主健康和健身的影响。对于果蝇微生物组的研究,高通量微生物学平台将包括以 96 孔板格式处理苍蝇样品、无需细菌裂解的苍 蝇 裂解、点镀效率、使用荧光和区分多个荧光团的能力、用于 CFU 板可重复成像的受控光环境以及可靠的自动菌落计数软件。本文介绍了一种针对gnotobiotic果蝇CFU测定优化的方法,该方法简单,快速且自动化。该协议概述了一种新的工作流程,结合了以前发表的方法的最佳方法,并针对探索 果蝇中的肠道微生物组进行了优化。
这里介绍的详细技术使CFU计数实验中可以评估的样品数量增加了>100倍。该技术通过使用96孔板格式测定单个苍蝇,推进了果蝇12,35,36微生物组实验的现有方法。此外,它应用了更有效的点镀方法19,31以及具有摄影和菌落计数平台的自动化工作流程。这种方法对果蝇的意义在于将实验标准化为 96 孔板格式,从而能够同时处理大量生物重复,实现 CFU 的高通量定量。
96孔平台表明,转移频率的增加和瞬时细菌的“清除”导致样品之间的平均丰度和变化显着降低(图1B,C),证明了这种改进方案的严格性。共同居住苍蝇的一个限制是苍蝇之间细菌的水平转移。建议的解决方案是以96孔板的形式单独饲养苍蝇,例如全动物喂养平板38。
虽然在乙醇中洗涤苍蝇时没有观察到细菌负荷的显着降低,但这些苍蝇仅在外部细菌存在下保存了3天。长时间的住房可能允许更大的细菌负荷积累39。因此,仍然建议用乙醇洗涤。
将苍蝇转移到96孔板中是设置工作流程的关键第一步(图1A)。一旦苍蝇被清洗,它们就会一次一个地分配到井中。在此阶段,板图可用于记录每个孔中存在哪些条件,并添加任何注释,例如“苍蝇丢失”。均质化是另一个关键步骤,但有一些重要的注意事项。当苍蝇存在时,细菌在均质化过程中存活下来(图1D,E),据推测,当细菌在苍蝇的肠道内时,这一原理也是如此。然而,当细菌仅在珠子打浆板中均质化时,它们也会被杀死,这表明均质化在某些情况下可以杀死细菌细胞,例如,如果对解剖的肠道进行均质化,这一限制可能很重要。值得注意的是,均质化时CFU的损失取决于样品中CFU的数量,当每孔使用~105 CFU时,损失最小。通过中途停止均质化并在冰上冷却板,可以实现CFU的进一步保存。
根据对照实验,在该协议中进行了5分钟的均质化,其中已知数量的CFU与无菌苍蝇混合,这在经验上对苍蝇细菌起作用。较少的跳动导致存在较大的苍蝇部件,从而干扰移液,而~10分钟的均质化时间明显更长,使CFU计数更加可变。与圆柱形2 mL管相比,观察到锥形板孔的较小体积和角度形状会降低磁珠跳动效率。这种通用方法的许多变体是可能的,包括使用哪种细菌菌株、哪种珠子跳动容器、哪些珠子和哪种苍蝇基因型。单个用户案例需要使用积极的控制来建立他们的方法。
以特定方式采用点镀方法:将PBS中植物 乳杆菌 WF的1:2稀释液点样到MRS板上,并在30°C下孵育2天(可以实施更短的孵育时间以产生更小的菌落大小)。该方法需要对设备进行一些前期投资,主要是磁珠打浆器和96通道移液器(图2A),这对于稀释系列和点镀都是必需的。但是,可以使用较便宜的选择,包括带有开槽引脚的96孔板复制器。稀释系列是影响CFU计数结果准确性的关键步骤。就故障模式而言,移液器吸头可能会被飞部件或玻璃珠堵塞,移液器吸头无法正确密封到移液器上或由于其他原因而失效。所有这些问题都导致受影响油井的计数不足,应加以监测。稀释系列的每一步的充分混合也至关重要。每次稀释液应通过将板放在摇板器上或上下移液 15-20 次来彻底混合,这也可用于冲洗吸头。通过从最稀释到最不稀释的板点样,吸头可以重复使用整个稀释系列。使用 1:2 稀释度,在 2-25 个菌落的范围内计数准确,跨越一个数量级(图 2C)。因此,1:10稀释可节省时间和材料。另一个可以利用的变量是孵育时间,可以调整孵育时间以产生更小的菌落,从而通过防止相邻菌落的合并来增加可计数斑点的范围。
板的高质量照片至关重要,因为它成为分析CFU的原始源数据,并且可以无限期存档。FluoroBox旨在生成具有均匀光强度的平板照片,从而最大限度地减少琼脂表面的眩光。此外,该设计能够使用单色LED灯和彩色照片滤光片选择性地拍摄荧光菌落(图3A)。像FluoroBox这样的设置的构建,具有受控的照明和相机设置,可以大大提高CFU图像的可重复性,这对于自动分析非常重要。菌落形态、荧光强度以及时间或密度对菌落生长的影响只是可以使用照片分析的几个特性。如果不使用荧光细菌,则可以在没有滤色片和单色灯的情况下构建照片盒,从而降低成本和复杂性。如果实验室使用不同的荧光团,则可以使用不同的激发光和发射滤光片代替此处推荐的激发光和发射滤光片。使用应用程序通过WiFi连接到平板电脑的相机对于自动快门功能以防止晃动和易于数据传输都很有用。图像可以传输到平板电脑,然后使用无线文件传输软件传输到笔记本电脑。具有这些功能的推荐相机在 材料表中注明。
Count-On-It是用ImageJ编写的插件。自动 CFU 计数软件将板图像分割成统一的 96 孔网格,对每个网格细胞中的菌落进行计数,并将结果批处理到简单的电子表格中。由于专色网格在印版和照片中的位置始终存在变化,因此用户必须使用 Croptacular 插件手动使网格与照片保持一致。这也有助于排除板边缘附近有眩光的区域。设置阈值是从图像中获取最准确的 CFU 计数的关键。如果阈值设置得太高,菌落将合并;如果阈值设置得太低,菌落将被排除在外。设置阈值后,宏应用高斯模糊来柔化边缘并减少锯齿,分水岭过滤器划分重叠的菌落,并使用分析粒子对斑点进行计数。
有时,特定地点的菌落密度过高。Count-On-It提供了一种处理此问题的方法。为了估计具有部分合并菌落的网格细胞中的菌落数量,首先将整个板中圆形斑点的平均面积取为Cavg。然后,将斑点A 1 的面积除以圆形斑点 A1/C的平均面积。 此数字四舍五入到最接近的整数,这是 blob 中菌落数的估计值。此功能是阈值会影响计数结果的原因之一:根据阈值对合并斑点的影响,相对平均菌落面积与合并斑点面积会有所不同。
所介绍的方法有几个局限性。其中包括需要从 96 孔板准确分配液体培养基的设备。这种设备,无论是 96 通道移液器还是开槽复制器销工具,可能需要花费数千美元才能获得。存在更便宜的替代品,但不太准确。通过 Count-On-It 自动 计数也存在一些限制。例如,如果仅根据大小分隔混合种群中的两种菌落类型,则 blob 计数将无法将菌落分配给正确的类型。在这种情况下,需要从计数中消除带有斑点的斑点。基于形态学的菌落进一步分化将是目前尚未实施的方法的有价值的扩展。使用选择性培养基(包括菌株特异性营养素和抗生素)简化了对复杂图像分析的需求。
在 96 孔板中维持果蝇实验可使可在单个实验中测试的样品和条件数量成倍增加,并且可以促进 果蝇-细菌关联表型的高通量筛选。我们设想这种方法可以通过使用选择性培养基来区分复杂混合物中的许多细菌菌株来扩展。该方法不仅限于对苍蝇微生物组的研究。CFU的定量在微生物学的许多应用中都很常见,从饮用水中的大肠菌群计数到病原体的鉴定。这里介绍的CFU电镀系统可实现高通量筛分,以及结果的自动采集、处理、存储和交付。
The authors have nothing to disclose.
Kerwyn Casey Huang博士,Andrés Aranda-Díaz博士,Ted Cooper和Ludington实验室的成员对该协议的开发提供了宝贵的意见。资金由NSF IOS拨款2032985,NIH拨款DP5OD017851,加拿大卡内基研究所拨款和卡内基科学研究所捐赠基金提供。
Bead beating and spot plating | |||
Fly vials | Genesee | 32-121 | autoclavable |
Fly vial stoppers | Genesee | 59-201 | autoclavable |
Hand Applicator | 3M | 3M PA1 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390 | |
Mini-Beadbeater 96 | BioSpec | 1001 | |
Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm | BioSpec | 11079105 | |
MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner | Labnet | LI-CF-P1000 | |
Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor | Mettler Toledo | 30296705 | Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific |
TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural | USA scientific | 1402-9220 | Must be polypropylene for heat sealer |
Thermal Bond Heat Seal Foil | 4titude | 4ti-0591 | Keep sterile |
Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile | SPL Life Sciences | 31001 | For making rectangular agar plates |
Photobox construction | |||
¼”-20 X ½” Bolts (X2) | Amazon | ASIN: B07BP1WR3H | To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works. |
¼”-20 x ½” Connector Nut | Amazon | UPC: 799862376780 | AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important. |
¼”-20 x ¾” bolts (X3) | Amazon | ASIN: B003QZSZY4 | For the plate holder. Brand not important. |
1/8” x ½” washer | Amazon | UPC: 611982484599 | Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
18 Gauge Wire – Two Conductor Power Wire – 18 AWG Power Wire – 10ft | Superbrightleds.com | WP18-2 | |
22-10 AWG Red Wire Nut – WN-R2210 – Quantity 4 | Superbrightleds.com | WN-R2210 | |
22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector – 22-18 AWG – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SCFP-2218 | |
4" Solderless Clamp-On Jumper Connector – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-2 | |
4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-1 | |
6” drawer handle | Amazon | ASIN: B07Z331P99 | Any drawer handle should work. |
6” Drawer slides | Btibpse | UPC: 712243424979 | Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders. |
8-32 x ½” Cap Nuts (x4) | Amazon | ASIN: B00HYLZB98 | Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
8-32 x ½” Nylon Bolts (x4) | Amazon | ASIN: B07KX9T7NF | To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
Acrylic Glue | SCIGRIP | Ean: 7844908489337 | SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle |
Black Cable Ties – 10 Pack – 4 Inch Long | Superbrightleds.com | CT-B04-10 | |
Camera L-Bracket | WLPREOE, Vikerer, Unbranded | ASIN: B09X46YKQZ | The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
Canon T series camera for tethering option OR | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.. | 1894C002 | The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model). |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Blue – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BBLU-B6A-08C1M-24V | |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Green – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BGRE-B6A-08C1M-24V | |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Natural White 4000K – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-A40K80-B6A-08C1M-24V | |
Drill with ¼”, 1/8” drill bits | Black & Decker | BDCDD12PK | Brand not important. |
Flat Black Spray Paint, 2X Ultra-Matte | Rustoleum | 331182 | Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important. |
Laser Cut Acrylic Walls | Big Blue Saw | www.bigbluesaw.com | Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera |
Mean Well LED Switching Power Supply – LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply – 24V DC – 20 Watt | Superbrightleds.com | LPV-20-24 | |
Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc. | DMC-ZS100K | Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good. |
Quick Release Plate | Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch | ASIN: B07417F21D | Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
Rubber Bands, Assorted sizes | BAZIC Products | Alliance Rubber 26649 | Rubber bands go on the plate holder. Brand not important. |
Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases – 3/4 inch base – Quantity 4 | Superbrightleds.com | CTMB-20 | |
SPST Round Rocker Switch – No LED – Quantity 3 | Superbrightleds.com | RRS-SP | |
Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm | Tiffen | 72R29 | |
Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm | Tiffen | 7258 | |
Software | |||
ImageJ64 | https://imagej.net/downloads | N/A | Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019 |
MacOSX | Apple | N/A | Has a useful batch rename feature in Finder to rename a group of photos to facilitate organizing and analyzing in Count-on-it. |
Unix | BSD | N/A | 64 bit |
Windows | Microsoft | N/A | 64 bit |